- Расшифровка гистологического исследования: на что обратить внимание?
- Что определяется с помощью игх?
- Макроскопическое описание
- Микроскопическое описание
- Гистологическое исследование – что это такое?
- Что служит материалом для патоморфологических (гистологических) исследований?
- Что определяется с помощью fish-теста?
- Для чего делаются срезы?
- Иммуногистохимия (игх)
- Как обрабатывают эти материалы для проведения гистологического исследования?
- Какие виды гистологических исследований наиболее информативны?
- Окрашенные срезы под микроскопом
- Результаты иммуногистохимического исследования
- Тема 2. методы исследования в гистологии. приготовление гистологического препарата. гистология
- Флуоресцентная гибридизация in situ (fish-тест)
- Патологоанатомическое заключение
Расшифровка гистологического исследования: на что обратить внимание?
Гистологическое заключение включает в себя несколько рубрик (полей):
Что определяется с помощью игх?
Иммуногистохимия позволяет оценить потенциальный темп роста опухоли, ответ на химио-, таргетную, гормональную терапию.
Макроскопическое описание
Заполняется как для биоптатов — не обязательно, так и для операционного материала, для которого имеет крайне важное значение в ряде случаев.
Микроскопическое описание
Описание изменений на микроскопическом уровне, не обязательно к заполнению, так как вся необходимая информация может быть отражена в поле «заключение».
Гистологическое исследование – что это такое?
Позволяет верифицировать опухоль – то есть определить из каких клеток она состоит (из какой ткани она развивается), степень ее дифференцировки (зрелости).
Рутинная окраска, выполняющаяся при гистологическом исследовании, позволяет выявить патологический процесс в анализируемом материале (биоптате, операционном материале):
- воспаление,
- специфическое воспаление,
- аномалия развития,
- опухоль.
Также, в большинстве случаев, благодаря рутинной окраске, можно определить степень злокачественности опухоли и, если она достаточно зрелая, то какова ее природа.
Что служит материалом для патоморфологических (гистологических) исследований?
Кусочек ткани пациента: кожи, слизистых оболочек, внутренних органов, костей, головного и спинного мозга и т.п., так называемый биоптат.
Процесс получения фрагмента ткани (биоптата) — биопсия – это несколько разных способов забора материала для гистологического исследования.
Виды биопсии:
- Пункционная биопсия – «тычок», тонкой или толстой иглой. Пункционные биоптаты редко имеют диаметр больше 1-2 мм.
- Ножевая биопсия – открытая или эндоскопическая (малоинвазивная), в том числе лапароторако-медиастиноскопия.
Биопсию внутренних органов делают под УЗИ-навигацией, либо с помощью хирургического вмешательства.
Операционный материал – это все что удалено во время операции, как правило, орган или его часть, или несколько органов и/или их частей с образованием (опухолью) или без него.
Что определяется с помощью fish-теста?
FISH-тест позволят диагностировать некоторые виды опухолей, определяет целесообразность использования некоторых химиотерапевтических препаратов.
Проведение гистологического исследования, и в первую очередь FISH-теста — это экспертная работа, которая зависит от квалификации специалиста. Очень многие мутации, которые выявляются в опухолях, не всегда являются метками опухолей, они могут находиться и в доброкачественных образованиях или нормальных тканях.
За год патологоанатомическое отделение НМИЦ онкологии имени Н.Н. Петрова выполняет около 20000 гистологических исследований (пациентов), из них около 5000 консультативных случаев (пересмотров), более 30000 ИГХ исследований, а также участвует в программе внешнего контроля качества ИГХ исследований NordIQ.
Специалисты отделения обладают огромным опытом проведения гистологических исследований и экспертными компетенциями.
Помните! Гистологические исследования – это отправная точка, от того насколько грамотно они выполнены зависит точность поставленного диагноза и эффективность назначенного лечения.
Скорость выполнения гистологических исследований и адекватность гистологического заключения зависят от ряда факторов:
- Качества стекол и блоков;
- Комплектности предоставления стекол (необходимо предоставить все стекла и блоки);
- Предоставление пациентом дополнительной информации, которая поможет верно интерпретировать данные гистологического исследования, ИГХ и FISH-теста, а именно: данные анамнеза заболевания, данные о сопутствующих заболеваниях, в первую очередь инфекционных (ВИЧ, гепатиты); все данные всех проведенных обследований и вмешательств: снимки — рентген, КТ, МРТ, УЗИ, протоколы операций, выписки.
После выполнения гистологического исследования пациент получает гистологическое заключение/протокол исследования гистологического материала.
Для чего делаются срезы?
Срезы делаются для рутинной окраски гематоксилинном и эозином, иммуногистохимического исследования и других видов исследований.
Срезы для всех исследований используются одинаковые, различается окраска, могут отличаться стекла, на которые они монтируются, так для ИГХ и FISH нужны специальные адгезивные стекла или заряженные стекла.
Гистостейнер
Блоки и стекла способны храниться долгие годы и использоваться для проведения дополнительных гистологических исследований, пересмотров, а также в научных целях.
Архив
Архив гистологических материалов собирается в НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова с 1927 года и содержит более 10 млн единиц хранения (микропрепараты — стекла, парафиновые блоки, архивные карточки, влажный архив).
Иммуногистохимия (игх)
Сложное многоэтапное исследование, выполняется после гистологического исследования на том же материале. Опухолевые срезы окрашиваются антителами, которые способны связываться антигенами (белками), которые несут опухолевые клетки. Разные опухолевые клетки несут разные антигены, к каждому из которых подобно ключа к замку подходит антитело.
Один из этапов ИГХ
ИГХ исследование — это комбинаторика. 100% специфичных и чувствительных к какой-то опухоли маркеров не существует, но есть набор антигенов, которые в определенном типе опухоль должны быть и набор тех, которых там быть не должно, таким образом ИГХ-панель строится так чтобы включать несколько антител, которые должны быть позитивны и несколько, которые должны быть негативны. Для разных опухолей различаются эти наборы позитивных/негативных маркеров.
При проведении прогностической ИГХ – выявлении маркеров чувствительности к терапии определяется набор таких маркеров для конкретных опухолей, например, рака молочной железы: рецепторы стероидных гормонов (эстроген, прогестерон), рецептор эпидермального фактора роста (HER2) и индекс пролиферативной активности Ki67 (скорости деления клеток).
Стекла окрашиваются последовательно — различными антителами красятся наборы маркеров в несколько этапов, процесс окраски стекол одним антителом занимает 48 часов.
Таким образом, каждое антитело наносится на отдельный срез ткани, монтированный на отдельное стекло, как правило с соответствующим внешним контролем, количество реакций (используемых антител) и этапов окраски может существенно варьировать в зависимости от конкретной диагностической ситуации, все зависит от индивидуальных особенностей опухоли.
Кому-то для этого будет достаточно 5 антител, а кому-то необходимо сделать 20 окрасок и более. Максимальное количество окрасок, которое нам приходилось делать – 212.
Поэтому точные сроки и стоимость этого исследования невозможно определить заранее. Разные по течению и прогнозу опухоли могут быть очень похожи друг на друга, только минимальные различия в окрашивании, с учетом клинических данных и данных других методов обследования, могут позволить установить верный диагноз.
Есть целый ряд доброкачественных опухолей, симулирующих злокачественные, в том числе высокоагрессивные, а некоторые злокачественные высоко дифференцированные опухоли трудно отличить от воспалительных и реактивных процессов. В таких ситуациях только опыт и квалификация патоморфолога, анализ всего комплекса доступной информации (снимки КТ, МРТ, рентген, протокол операции, и др.) позволяют поставить диагноз.
В грамотной интерпретации результатов ИГХ очень важна роль эксперта, ведь те случаи, с которыми приходится работать, в большинстве своем, сложные. Практически не существует антител, которые могут выступать в качестве 100%-х маркеров той или иной опухоли, врачу всегда приходится взвешивать различные вероятности.
Как обрабатывают эти материалы для проведения гистологического исследования?
1 Этап. Фиксация — «консервирование» биоптата в формалине — специальном химическом растворе, который предотвращает гниение, позволяет сохранить структуры ткани.
Фиксация биоптата может занимать от 6 до 24 часов – в зависимости от его вида и размера.
Операционный материал фиксируется дольше, в несколько этапов. Сначала предварительная фиксация, которая занимает примерно 12 часов. Затем вырезка нужных фрагментов и повторная фиксация еще 24 часа.
Соотношение объема материала к объему формалина должно быть 1:20.
Время фиксации сократить нельзя!
2 Этап. Процессинг — процесс обезвоживания, обезжиривания и пропитки материала парафином. Автомат перемещает кусочек материала из раствора в раствор.
В качестве растворов применяются: абсолютированный изопропиловый спирт (6-8 смен), ксилол (2 смены), расплавленный парафин (2 смены).
Программа разнится для «жирного» материала (к которым относятся, например, ткани молочной железы) и «нежирного» – 36 и 24 часа соответственно.
Процесс получения парафиновых блоков.
3 Этап. Изготовление парафинового блока. Кусок материала помещается в форму с расплавленным парафином (уже другим нежели во время процессинга – с более высокой температурой плавления) и охлаждается. Выполняется вручную, сложно ускорить.
Микротомия
4 Этап. Изготовление срезов. Толщина образца — кусочка ткани, залитого в парафин – 1-3 мм. Толщина каждого среза 4-5 мкм (0,004-0,005 мм). Выполняет лаборант с использованием специального инструмента – микротома.
Срезы монтируются на стекла и должны высохнуть.
Несмотря на то, что часть материала теряется при выравнивании в микротоме, при должном профессионализме, из одного образца — материала от одной биопсии, операционного материала от одной опухоли, возможно изготовить около 100 стекол (микропрепаратов).
Какие виды гистологических исследований наиболее информативны?
- Гистологическое исследование
- Иммуногистохимия (ИГХ)
- Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), может быть хромофобной (принцип тот же, другой тип метки)
Окрашенные срезы под микроскопом
При гистологическом исследовании биоптата и операционного материала можно оценить распространенность: размер опухоли и прорастание в окружающие ткани, насколько затронуты лимфоузлы и есть ли метастазы в отдаленные органы (если эти все структуры присланы для гистологического исследования).
Во время гистологического исследования изучаются все стекла от одного образца – материала, полученного от одного вмешательства — одной операции или одной биопсии, вне зависимости от их количества, это считается одной консультацией.
Сроки выполнения гистологического исследования зависят от количества микропрепаратов и от категории сложности того процесса, который в них обнаруживается, сроки могут удлиняться, особенно при необходимости использования дополнительных методов исследования и анализа дополнительных сведений.
Результаты иммуногистохимического исследования
В этом поле описано какие антитела использовались в данном случае и каков результат окрашивания: наличие окрашивание или его отсутствие, локализация в клетке при необходимости, а также процент позитивных клеток и интенсивность реакции, когда это имеет значение.
Тема 2. методы исследования в гистологии. приготовление гистологического препарата. гистология
Тема 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА
Основным методом исследования в гистологии является микроскопирование – изучение гистологических препаратов под микроскопом. В последнее время микроскопия сочетается с другими методами – гистохимией и гисторадиографией. Для микроскопии используют различные конструкции микроскопов, позволяющие изучать различные параметры гистологических препаратов.
Выделяются следующие виды микроскопии:
1) световая микроскопия (наиболее распространенный вид микроскопии, при этом разрешающая способность микроскопа составляет 0,2 мкм);
2) ультрафиолетовая микроскопия (разрешающая способность микроскопа составляет 0,1 мкм);
3) люминисцентная микроскопия (применяется для определения в исследуемом гистологическом препарате определенных химических структур);
4) фазово-контрастная микроскопия (применяется для обнаружения и изучения определенных структур в неокрашенных гистологических препаратах);
5) поляризационная микроскопия (используется в основном для изучения волокнистых структур);
6) микроскопия в темном поле применяется для изучения живых объектов;
7) микроскопия в падающем свете (предназначена для изучения толстых объектов);
8) электронная микроскопия (наиболее современный вид микроскопии, имеющий разрешающую способность 0,1 – 0,7 нм). Имеются две разновидности электронной микроскопии – просвечивающая (трансмиссионная) и сканирующая (или растворная) микроскопия, дающая отображение поверхностных ультраструктур.
Гистологические и цитохимические методы применяются для определения состава химических веществ и их количества в определенных структурах. Принцип метода заключается в химической реакции между реактивом и субстратом, содержащимся в исследуемом веществе. При этом образующиеся побочные продукты реакции можно обнаружить с помощью световой или люминисцентной микроскопии.
Метод гистоавторадиографии позволяет выявить состав химических веществ в исследуемых структурах и интенсивность обмена по включению радиоактивных изотопов. Данный метод чаще всего используется при экспериментах на животных.
Метод интерферонометрии позволяет определять сухую массу вещества в живых или фиксированных объектах.
Метод культуры клеток – это выращивание клеток в пробирках или в особых капсулах в организме и последующее изучение живых клеток под микроскопом.
Метод витального окрашивания – введение животным в кровь или в брюшную полость красителя (трепанового синего), который при жизни животного захватывается определенными клетками – макрофагами, а после забоя животного и приготовления препарата определяются и подсчитываются клетки, содержащие краситель.
Иммуноморфологические методы позволяют с помощью предварительно проведенных иммунных реакций (на основе взаимодействия антиген – антитело) определять субпопуляцию лимфоцитов, степень чужеродности клеток, проводить гистологическое типирование тканей и органов, т. е. определять их гистосовместимость для дальнейшей трасплантации.
Метод дифференциального центрифугирования – изучение отдельных органелл или даже их фрагментов, выделенных из клетки. Для этого кусочек исследуемого органа растирают, заливают физиологическим раствором, а затем разгоняют в центрифуге при различных оборотах (от 2 до 150 тыс. в 1 мин). В результате центрифугирования получают интересующие фракции, которые затем изучают различными методами.
Методы морфометрии – количественные методы. Они позволяют определять размеры и объемы ядра – кариометрия, клеток – цитометрия, органелл – электронная морфометрия, а также определять число клеток различных популяций и субпопуляций. Данные методы широко используются в научных исследованиях.
Различные экспериментальные методы – пищевая и водная нагрузка, физические методы (УВЧ, СВЧ, лазеры, магниты). Они применяются для изучения реакции интересующих структур на то или иное воздействие и сочетаются с методами морфометрии, цито– и гистохимии. Данные методы также применяются в научных исследованиях.
Таким образом, основным и наиболее распространенным методом изучения в гистологии является микроскопия. Приготовление гистологического препарата включает в себя следующие этапы.
1. Взятие материала – кусочка ткани или органа. При заборе материала необходимо выполнять следующие правила:
1) забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти или забоя животного, при возможности от живого объекта, чтобы как можно лучше сохранить структуру исследуемых клеток;
2) забор материала должен проводиться острым инструментом, чтобы не травмировать ткани;
3) толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий раствор смог проникнуть на всю глубину ткани;
4) обязательно необходимо произвести маркировку кусочка, при этом указываются наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата забора.
2. Фиксация материала. Данный этап проводится для того, чтобы остановить обменные процессы в клетке и сохранить ее от распада. Для этого взятый на исследование кусочек ткани погружают в фиксирующий раствор. Раствор может быть простым (спирт или формалин) и сложным (раствор Карнуа, фиксатор Цинкера). Фиксатор вызывает денатурацию белков и сохраняет структуру клеток в состоянии, близком к прижизненному. Фиксацию можно проводить также путем замораживания – охлаждением жидким азотом или струей углекислого газа.
3. Заливка кусочков ткани в уплотняющие среды (парафин, смолы) – или замораживание. Данный этап необходим для того, чтобы в последующем из исследуемой ткани можно было изготовить тонкий срез.
4. Приготовление срезов на микротоме или ультрамикротоме с помощью специальных ножей. После этого срезы для световой микроскопии приклеиваются на предметные стекла, а для электронной – монтируются на специальные сеточки.
5. Окраска срезов или их контрастирование (для электронной микроскопии). Перед окраской срезов необходимо удалить уплотняющую среду – выполнить депарафирование. С помощью окраски достигается контрастность изучаемых структур. Красители можно подразделить на основные, кислые и нейтральные. Наиболее широко применяются основные красители (гематоксилин) и кислые (эозин). Часто используются и сложные красители.
6. Просветление срезов в ксилоле и толуоле. Их заключают в смолы (бальзам и полистирол) и закрывают покровным стеклом.
После данных процедур препарат можно исследовать под световым микроскопом. Помещенные под стекло срезы для светового микроскопа могут долго храниться и многократно использоваться. Для электронной микроскопии каждый срез используется только 1 раз, при этом он фотографируется, и изучение структур ткани производится по электронограмме.
Если ткань имеет жидкую консистенцию (например, кровь, костный мозг), то препарат изготавливают в виде мазка на предметном стекле, который затем также фиксируется, окрашивается и изучается.
Из ломких паренхиматозных органов изготавливают препараты в виде отпечатка органа, проводят разлом данного органа, затем к месту разлома прикладывают предметное стекло, на которое приклеиваются свободные клетки. После этого препарат фиксируется и изучается.
Из некоторых органов (например, брыжейки, мягкой мозговой оболочки) или из рыхлой волокнистой соединительной ткани изготавливают пленочные препараты путем растягивания или раздавления между двумя стеклами с последующей фиксацией и заливкой в смолы.
Данный текст является ознакомительным фрагментом.
Флуоресцентная гибридизация in situ (fish-тест)
Это метод молекулярно-генетической диагностики в ткани.
FISH проводится в срезе ткани и позволяет привязать генетическую перестройку к конкретной опухолевой клетке.
В этом тесте также используются специальные красители, которые связываются только с определенными участками хромосом. Их называют зондами, которые могут быть помечены флуоресцентным или хромогенным красителем, визуализирующимися при помощи флуоресцентного или светового микроскопа.
Технические операции по подготовке гистологических стекол к этому исследованию занимает 2 рабочих дня.
Анализ препарата с помощью многоголового микроскопа.
Полученные микропрепараты очень чувствительны к внешней среде – они могут выцвести со временем, чтобы избежать потерь информации все FISH-препараты сканируются, создается их цифровая копия, которая доступна для внешнего пересмотра. Специалисты просматривают флуоресцирующий материал в темном поле, в анализе препарата принимают участие как минимум 2 специалиста. При необходимости используется и цифровой анализ.
Патологоанатомическое заключение
Содержит нозологическую/классификационную единицу, если ее возможно установить по исследованному материалу, то есть дает ответы на вопросы:
- Это первичная опухоль или метастаз?
- Где локализован первичный опухолевый очаг?
- Каков гистологический тип опухоли (из клеток какого типа она состоит).
Также приводятся все необходимые прогностические данные: степень дифференцировки, параметры, влияющие на стадию, состояние краев резекции, если возможно их оценить и т.п.
