Влияние экзополисахаридов бактерий Paenibacillus polymyxa 1465 на рост и защитные реакции пшеницы – тема научной статьи по биологическим наукам читайте бесплатно текст научно-исследовательской работы в электронной библиотеке КиберЛенинка

Новый таксономический маркер клубеньковых бактерий рода rhizobium и его эволюция

1 ФГБУ науки Институт биохимии им. А. Н. Баха Российской академии наук, Москва, Россия; 2 ФГБУ Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук, Москва, Россия; 3 Институт сельского хозяйства Крыма НААН Украины, Симферополь, АР Крым

Ш Предложен новый таксономический маркер (Ып-регион), позволяющий изучать разнообразие представителей рода Rhizobium на уровне вида — группы штаммов. С его помощью были выделены группы штаммов Rhizobium, которые невозможно было детектировать другими методами, что коррелировало с эволюционной близостью бактерий. Разработанный подход к созданию маркерных систем позволяет эффективно описывать внутри- и межвидовое генетическое разнообразие клубеньковых бактерий и давать их оценку на перспективность использования в сельскохозяйственной практике. С помощью предложенной маркерной системы описаны изоляты бактерий рода Rhizobium, выделенные из различных эколого – географических зон Украины.

Ш Ключевые слова: Rhizobium; филогения; таксономия; детекция; разнообразие; saAFLP; Ып-регион ПЦР; ПЦР-RFLP; 16S рибосомальная РНК; 16S-23S рибосомальная РНК

Поступила в редакцию 29.11.2021 Принята к публикации 05.06.2021

УДК 575.17:582.632.1:630*81 1.6

новый таксономический маркер клубеньковых бактерий рода йн^овшм и его эволюция

Известно, что клубеньковые бактерии разделяют на две большие группы — быстро- и медленнорастущие, отличающиеся по скорости роста, характеру метаболизма углеводов и азотистых соединений (Rhizobiaceae. Молекулярная биология бактерий, взаимодействующих с растениями, 2002), специфичности взаимодействия с различными бобовыми культурами (широ-ко-и узкоспецифичные) (Martínez-Romero, Caballero-Mellado, 1996).

В настоящее время, как правило, таксономию и эволюционные взаимоотношения порядка Rhizobiales изучают с помощью сравнения нуклеотид-ных последовательностей гена 16S рРНК. Однако такая оценка не всегда соответствует данным, полученным по другим локусам (Gaunt et al., 2001). Вследствие частых межвидовых рекомбинаций между различными аллелями таксономически важных генов (таких как 16S рРНК, dnaK, nod), не всегда удается адекватно классифицировать изоляты ризобий, что приводит к необходимости получения дополнительных генетических данных (Suominen et al., 2001; Eardly et al., 2005; Vinuesa et al., 2008). Особый интерес в качестве модельного объекта данного порядка представляет род Rhizobium (Frank, 1889), имеющий сложную таксономическую структуру, которую сложно изучать существующими в настоящее время методами.

Целью исследований являлась разработка специфических для клубеньковых бактерий рода Rhizobium генетических маркерных систем, позволяющих изучать их на уровне вида — группы штаммов.

С целью создания быстрого, дешевого и достоверного способа детекции и изучения биоразнообразия популяционной структуры клубеньковых бактерий нами были предложены методы: saAFLP (Zotov et al., 2021) и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей hin-региона (Зотов с соавт., 2021).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы. В работе были использованы 52 изолята клубеньковых бактерий рода Rhizobium из коллекций полезных микроорганизмов различных научных учреждений Украины и России: Института сельского хозяйства Крыма Национальной академии аграрных наук Украины (ИСХК НААН), г. Симферополь; Института сельскохозяйственной микробиологии и агропромышленного производства Национальной академии аграрных наук, г. Чернигов; института микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного Национальной академии наук Украины, г. Киев; Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук, ВНИИСХМ РАСХН, г. Санкт-Петербург. 9 штаммов из коллекции ВНИИСХМ РАСХН использовались в качестве типовых. Изоляты коллекции отдела микробиологии ИСХК НААН были выделены в разных эколого-географических зонах Украины: степи, лесостепи и Полесья (табл. 1).

Идентификация. Культуральные и физиолого-биохимические свойства изолятов Rhizobium sp. изучали согласно общепринятым методам микробиологии и биохимии (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991; Берджи, 1997) и методическим рекомендациям ВНИИСХМ РАСХН (Возня-ковская, Попова, 1985).

оо

съ

Г) «

съ

а «

н О

ю о

Исследуемые штаммы ризобий и их группировка с использованием различных молекулярных методов

Таблица 1

со

со 2

о со

ОО

Штамм Род/Вид Сходство по 168 рРНК, % Растение-хозяин (источник) Географическое происхождение* 1Т8ПЦР-1*ГЬР генотип** Группа ваАГЬР Ып-регион (класс/генотип) Длина Ып-региона, п.о.

У-1 Я. 1ецит1П08агит 100 горох Украина (ВО) 6 1А.1 1/А 270 410

28 100 горох Украина (ЛО) 1 I А. 1 1/А 270 410

П-2 100 горох Украина (АРК) 1 I А. 1 1/А 270 410

Ч-14 100 горох Украина (ЛО) 1 I А. 1 1/А 270 410

К-29 100 горох Украина (ЛО) I А. 1 1/А 270 410

34 100 горох Украина (АРК) 1 1А.5 1/А 270 410

65 100 горох Украина (00) 1 1А.6 1/А 270 410

У-2 100 горох Украина (ВО ) 1 1А.7 1/А 270 410

У-4 100 горох Украина (ВО) 1 1А.З 1/А 270 410

У-5 100 горох Украина (ВО) 1 1А.З 1/А 270 410

32 100 горох Украина (ЛО) 1 1А.З 1/А 270 410

32-2 100 горох Украина (ЛО) 1 1А.З 1/А 270 410

682 100 фасоль Украина 1 1А.8.1 1/А 270 410

31 99,93 горох Украина (ЛО) 1А.4 1/А 270 410

261б5′ 100 горох Украина 1А.2 1/А 270 410

Г-8 100 горох Украина (ХО) 1 1А.2 1/А 270 410

24 100 горох Украина (ЛО) 1 1А.2 1/А 270 410

У-3 100 горох Украина (ВО) 1 1А.2 1/А 270 410

У-11 100 горох Украина (ВО) 1 1А.2 1/А 270 410

У-12 100 горох Украина (ВО) 1 1А.2 1/А 270 410

ФА-4 100 фасоль Украина (ХО) 1 1А.8.2 1/А 270 410

Ф-1 100 фасоль Украина (ХО) 1 1А.9 1/А 270 410

ФА-34 100 фасоль Украина (ХО) 1 1А.8.3 1/А 270 410

13265′ 99,93 клевер Россия (ЛО) 13 1А.10 1/А 270 410

245а5′ 100 горох Россия (МО ) 4 1В.1 1/В 320 470

24 8Ь 100 горох Украина 3 1В.2 1/В 320 470

У-9 100 горох Украина (ВО) 3 1В.2 1/В 320 470

У-7 100 горох Украина (ВО) 5 1В.З 1/В 320 470

965′ 100 бобы Литва 7 1В.1 1/В 320 470

975′ 100 бобы Латвия 8 1В.2 1/В 320 470

Б-6 100 бобы Украина (ВО) 9 1В.2 1/В 320 470

i §

Со

с»

ел

Таблица 1 (окончание)

оо

Г) «

а ¿0 00

съ

а «

н О

ю о

ел ю

со со 2

о со

О0

Б-8 Я. ^¿штпозагит 100 бобы Украина (ВО) 9 1В.2 1/В 320 470

Б-17 100 бобы Украина (ВО) 9 1В.2 1/В 320 470

Б-18 100 бобы Украина (ВО) 9 1В.2 1/в 320 470

Б-9 100 бобы Украина (ВО) 10 1В.З 1/В 320 470

Б-15 100 бобы Украина (ВО) 10 1В.З 1/В 320 470

Б-16 100 бобы Украина (ВО) 10 1В.З 1/В 320 470

Б-25 100 бобы Украина (ВО) 10 1В.З 1/В 320 470

КП15 100 клевер Украина (АРК) 11 1В. 3.2 1/В 320 470

мк 100 клевер Украина (АРК) 12 1В.2 1/В 320 470

КК 100 клевер Украина (АРК) 12 1В.2 1/В 320 470

кпоп 100 клевер Украина (АРК) 13 1В.3.1 1/В 320 470

КП012 100 клевер Украина (АРК) 13 1В.3.1 1/В 320 470

КЛ-90 100 клевер Украина (АРК) 14 1В..З.З 1/В 320 470

КЛ-91 100 клевер Украина (АРК) 14 1В.3.1 1/В 320 470

ФК-0 100 фасоль Украина (ХО ) 15 IЬ.1.1 1/ь 320

ФК-4 100 фасоль Украина (ХО ) 15 I Ь.1.2 1/ь 320

ФК-6 100 фасоль Украина (ХО ) 15 I Ь.1.3 1/ь 320

108* 100 фасоль Украина (ХО ) 15 I Ь.1.4 1/ь 320

105 100 фасоль Армения 16 II.1.1 п/с 470 655

108** 100 фасоль Украина (ХО ) 16 II.1.2 п/с 470 655

ФН 100 фасоль Украина (ХО ) 16 II.1.3 п/с 470 655

ФН-6 99,09 фасоль Украина (ХО ) 17 III.1 ш/о 250

ФС Я. ¿¡агсИпи 99,72 фасоль Украина (ХО ) 18 IV. 1 1У/Е 260

700″ Я. еШ 99,93 фасоль Мексика 19 VI 370 520

912″ Я. £г//е£г/е 99,86 козлятник Россия (ЛО) 20 VII У1/С 230

913″ 99,86 козлятник Эстония 20 VII У1/С 230

916″ 99,86 козлятник Россия (ЛО) 20 VII У1/С 230

926″ 99,86 козлятник Украина 20 VII У1/С 230

К-3 99,86 козлятник Украина 20 VII У1/С 230

К-18 99,86 козлятник Украина 20 VI.! У1/С 230

* — Винницкая обл. (ВО ); Одесская обл. (00); АР Крым (АРК); Московская обл. (МО ); Ленинградская обл. (ЛО); Луганская обл. (ЛО); Харьковская область (ХО). ** — Генотипы по совокупности данных РРБР с использованием эндонуклеаз рестрикции А1и, М$р и НаеIII

i §

Со

с» 1

Выделение ДНк. Для выделения препаратов суммарной клеточной ДНК штаммы культивировали на агаризованной среде TY: дрожжевой экстракт — 1 г/л; пептон — 10 г/л; CaCl2—0,4 г/л; агар — 20 г/л (Beringer, 1974). ДНК была выделена из свежих культур на 1—2 сутки их роста с помощью метода сорбции на магнитных частицах (набор «Минипреп» , «Си-лекс», Россия).

Single adapter AFLp анализ (saAFLp) (zotov et al., 2021). Рестрикционный анализ проводили одновременно с лигированием в 10 мкл смеси, содержащей 80 нг образца ДНК, 1х лигазный буфер («Fermentas», США), 10 пкМ одноцепочечного адаптера (Ad.CTAG1: 5′-ctagCTGGAATCGATTCCAG-3′), 5 ед. Т4 ДНК ли-газы (“Fermentas”, США) и 1 ед. рестриктазы XmaJI (Xbal). Полученную смесь инкубировали при 37 оС в течение 2 часов, после чего доводили реакционный объем до 100 мкл. ПЦР проводили на амплификаторе Mastercycler gradient Eppendorf в 25 мкл смеси, содержащей 1х буфер для ПЦР, 2.8 мМ MgCl2, 0.2 мМ dNTP, в качестве ДНК-матрицы — 2 мкл рестрикци-онно-лигазной смеси, 0,4 мкМ праймера (Pr.CTAG1: 5′-CTGGAATCGATTCCAGctag-3′), комплементарного адаптеру и 1 ед. ДНК-полимеразы BioTaq («Диалат ЛТД», Россия). Для ПЦР амплификации был использован следующий температурно-временной профиль: первоначальная денатурация при 94 оС — 2 мин; последующие 30 циклов: 94 оС — 30 с, 40 оС — 30 с, 72 оС — 3 мин; окончательная элонгация — 5 мин при 72 оС.

ПцР-амплификация гена 16S рРНк и hin-ре-гиона. ПЦР анализ и последующее секвенирование (Sanger et al., 1977) нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК проводили с использованием прайме-ров FD1: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ и RD1: 5-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′ (Weisburg et al., 1991). Амплификацию hin-региона проводили с использованием разработанных нами специфических для рода Rhizobium праймеров и следующего протокола: первоначальная денатурация при 94 оС — 2 мин; последующие 30 циклов: 94 оС — 30 сек, 55 оС — 30 сек, 72 оС — 1 мин; окончательная элонгация 5 мин при 72 оС. Амплифи-цированные фрагменты детектировались при помощи электрофореза в 1,5% агарозном геле. Нуклеотидные последовательности определяли на автоматическом сек-венаторе Genetic Analyzer 3130xl («Applied Biosystems», США).

Restriction fragment length polymorphism анализ (RFLp). Амплификацию межгенного региона рибосо-мального кластера (ITS) для последующего рестрикт-ного анализа проводили с использованием праймеров FGPS1490—72: 5′-TGCGGCTGGATCCCCTCCTT-3′ (Normand et al., 1992) и ITS_R: 5′-CGCAGCGTATCA-CGTCCTTC-3′, адаптированных для бактерий рода Rhizobium. Рестрикционный анализ проводился с ис-

пользованием эндонуклеаз рестрикции AluI, HaelII и MspI («Fermentas», США) согласно инструкциям производителя. Обработанную рестриктазами ДНК анализировали при помощи электрофореза в 4,0% агарозном геле.

Анализ нуклеотидных последовательностей. Первичный сравнительный анализ полученных последовательностей с последовательностями базы данных Ген-Банка был проведен с помощью программы NCBI Blast (Altschul et al., 1990). Выравнивание последовательностей проводили с помощью программы CLUSTALW 1.75v. (Thompson et al., 1994). Проверка и редактирование были осуществлены с помощью редактора «BioEdit 7.0.5.3» (Hall, 1999). Филогенетические деревья были построены в программе Mega 3.1 (Kumar et al., 2004) с помощью алгоритма Neighbor—Joining NJ (Nei and Kumar, 2000). Попарные генетические расстояния между последовательностями были определены по двухпа-раметрической модели Кимуры (Kimura, 1980). Уровень нуклеотидного полиморфизма вычислен в программе DnaSP 5.10 (Rozas et al., 2021).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Физиолого-биохимические свойства бактерий рода Rhizobium

Род Rhizobium традиционно классифицируют на основании фенотипических характеристик, таких как способность к образованию клубеньков и физиолого-биохимические свойства. По результатам проведенных анализов все изученные изоляты принадлежали роду Rhizobium и обладали специфичностью к инфицированию группы растений гороха, бобов, чины, вики, чечевицы (bv. viciae), а также растений фасоли (bv. phaseoli), клевера (bv. trifolii) и козлятника (R. galegae).

Изоляты клубеньковых бактерий коллекции отдела микробиологии ИСХК НААН показали высокую эффективность в симбиозе с современными сортами бобовых культур в почвенно-климатических условиях Украины. Это позволило повысить продуктивность растений на 10 — 30%, увеличить содержание белка в зерне на 2—6%, а в зеленой массе — на 1—3% даже при наличии в почве популяции аборигенных или ранее интродуцированных ризобий Rhizobium sp. (Дидо-вич, 2008).

Генетическое разнообразие бактерий рода Rhizobium

Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S ррНК

Полные ДНК-последовательности гена 16S рРНК (1445 п. о. по геному R. leguminosarum bv. viciae 3841) были получены для всех исследуемых изолятов и штаммов Rhizobium sp. Для каждого вида клубеньковых бактерий родов Rhizobium, Sinorhizobium и Mesorhizobium

в базе данных NCBI были найдены последовательности гена 16S рРНК типовых штаммов (Kwon et. al., 2005), которые также были взяты для анализа. В качестве удаленного контроля была использована ДНК-последовательность 16S рРНК типового штамма Bradyrhizobium japonicum DSM30131T и построено филогенетическое дерево (рис. 1).

По результатам анализа все исследуемые изоляты были достоверно отнесены к 4 видам рода Rhizobium: R. leguminosarum (Frank, 1889), R. etli (Segovia et al., 1993), R. giardinii (Amarger et al., 1997) и R. galegae (Lindström, 1989) (табл. 1). Нуклеотидные последовательности вида R. leguminosarum имели одну внутривидовую замену G/A/C/T (1069 п. о. от начала гена по геному NC_008380). У штаммов R. giardinii, R. galegae и R. etli внутривидовой полиморфизм ДНК-последовательностей гена 16S рРНК обнаружен не был.

Однако, вследствие низкой разрешающей способности, частым рекомбинационным событиям и горизонтальному переносу, ген 16S рРНК не может быть применён для достоверного определения филогенетической структуры рода Rhizobium на видовом уровне (Willems, Collins, 1993; Gaunt et al., 2001; Eardly et al., 2005). По результатам построения филогенетического дерева видна полифилетичная природа ризобий, что было показано и ранее (Martinez, 1994; Новикова, 1996).

RFLP-анализ межгенного региона 16S-23S рРНК (ITS)

Нами был проведен анализ ITS бактерий рода Rhizobium, который показал, что 22 из 61 штамма имеют 2 продукта ПЦР-амплификации, отличных не только по длине, но и по нуклеотидному составу (Laguerre et al., 1996; Palmer, Young, 2000; Vessey, Chemining’wa, 2006). С помощью рестрикции полученных продуктов ITS-ПЦР на внутривидовом уровне были достоверно выделены 20 ITS-RFLP генотипов (табл. 1). Также было проведено определение нуклеотидных последовательностей ITS 20 штаммов Rhizobium sp. (по одному штамму каждого ITS-RFLP генотипа), и в совокупности с нуклеотидными последовательностями референсных штаммов из ГенБанка (Kwon et al., 2005) было построено филогенетическое дерево (рис. 2). Высокий уровень нуклеотидной изменчивости ДНК-последовательности ITS-региона позволяет различать близкородственные штаммы, однако многокопийность ITS-регионов затрудняет интерпретацию филогенетических связей (Gürtler and Stanisich, 1996). Так, по данным сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей ITS-региона штаммы 105 и FA-4 (симбионты фасоли) с единичными продуктами ITS-ПЦР относились к виду R. etli. К этому же виду относились и штаммы KK, KP012 и KL91 (симбионты клевера). В то же время по ДНК-последовательностям гена 16S рРНК все эти

штаммы принадлежали к виду R. leguminosarum. Интересно, что геномы симбионтов клевера КК, КР012 и КЬ91 несут в своем составе 2 типа ITS-региона, при этом один принадлежит к виду R. leguminosarum (^-Ь — продукт ITS-ПЦР высокой молекулярной массы), другой — к R. etli (Н^^ — ITS-ПЦР продукт более низкой молекулярной массы). Вероятно, это указывает на горизонтальный перенос или частые реком-бинационные события, происходящие между ДНК-последовательностями различных видов бактерий данного рода (Terefework et а1., 1998).

saAFLP анализ

Для достоверного анализа внутривидового полиморфизма штаммов рода Rhizobium был использован saAFLP с применением эндонуклеазы рестрикции — ХтаИ (2оЬу et а1., 2021).

По данным saAFLP 23, штамма R. leguminosarum Ьу. юкеае, инокулирующие горох, были достоверно разделены на два генотипа, относящиеся к генетически разнородным группам А и В (рис. 3, а), имеющим меньше 15% общих фрагментов. С помощью данного анализа удалось установить генетическую неоднородность штаммов R. leguminosarum из Винницкой и Херсонской областей Украины (рис. 3, а, табл. 1). Таким образом, внутри однородной по последовательности гена 16S рРНК группы штаммов был показан значительный полиморфизм продуктов saAFLP и выявлено 4 генетические группы клубеньковых бактерий. Вероятно, данная вариабельность связана с определенными генетическими изменениями в процессе адаптации к различным эколого-географическим зонам и/или рас-тениям-хозяинам (Terefework et а1., 2001).

Шесть изолятов, симбионтов козлятника, отнесенных с помощью анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК к R. galegae, представляли собой генетически однородную группу штаммов с единым характерным для нее профилем saAFLR Штаммы, отнесенные по анализу ДНК-последовательности 16S рРНК к видам R. etli и R. giardinii, также имели свои уникальные saAFLP-профили.

Как известно, метод saAFLP является удобным инструментом для выбора таксонспецифичных маркеров. Одним из таких маркеров, найденных и изученных в данной работе, стал ^п-регион (от латинского Ып — уникальный, неповторимый) (Зотов с соавт., 2021. Заявка на патент рег. № 201 1 135461 от 25.08.201 1). Маркер был обнаружен экспериментально при saAFLP-анализе штаммов R. leguminosarum Ьу. viceae (рис. 3).

Анализ Ып-региона

В данной работе были амплифицированы и секвени-рованы полные нуклеотидные последовательности Ып-региона (2о^у et а1., 2021) 61 штамма бактерий рода

R. leguminosamm (44)

R. leguminosamm bv. hifolii 1326s1 R. leguminosamm ln viceae 31 R. leguminosamm bv.phaseoli 108* R. leguminosamm bv. phaseoli ФК-6 R. leguminosamm bv. phaseoti ФН R. leguminosamm bv.pluiseoli 108** R. leguminosamm b\ phaseoli ФК-4 R. leguminosamm bv. phaseoli ФК-0 R. leguminosamm bv. phaseoli 105

-R. leguminosamm 1n phaseoli ФН-6

— Rhizobinm radiobacter K84 (CP000628) A , Rlu’zobium rhizogenes IFO 13257 T (D14501)

■ Rhizobinm lusitanum Pl-7 T (NR 043150)

• Rlu’zobium tropici CUT 899 T (EU4SS752) 99*-Rlu’zobium haiuanense 166 T (l~~10~S) Г Rlu’zobium etli CIA T 652 (NC 010994) »1R. etli 700-st

j—Rlu’zobium sullae IS 123 T (Y 10170) — Rlu’zobium intligoferae CCBAU 71042 T (AF36406S) Rlu’zobiumyanglingense SH22623 T (AF003375) r Rlu’zobium gallicum R602sp T (US6343) — Rlu’zobium mongolense USDA 1844 T (U89S17) ■ Rhizobinm loessense CCBAU 7190B T (AF364069) r Rhizobinm galegae ATCC43677 T (D11343) R. galegae K-3 R. galegae 926-st R. galegae 916-st R. galegae 913-st R. galegae K-18 R. galegae 912-st L Rhizobinm Imautlense S02 T (AF025S52) 931-Rhizobinm nndicola LMG11875 T (Yl~04~)

И I-

«I— Rhi:.

■ Rhizobinm vitis NCPPB3554 T (D0125S)

■ Rhizobinm mbilFO 13261 T (DO1259)

■ Rhizobinm tnmtfaciens ЖРРВ2437 T (DO1256) j- Rhizobinm giariliuii H152 T (U86344) ¡1R. giariliuii ФС

j- Mesorhizobium phirifarium LMG 11892 T (Y14158) 72 L Mesorhizobium amoiphae ACCC19665 T (AF041442) .Mesorhizobium liuakuiiIFO 15243 T (D13431) Mesorhizobium meditenaneum UPM-Ca36 T (L38825)

Mesorhizobium tianshanense USDA 3592 T (AF04144″) — Mesorhizobium chacoense PR5 T (AJ278249)

Mesorhizobium ciceri UPM-C’a7 T (U07934) 991- Mesorhizobium lotiLMG 6125 T (X67229) Sinorhizobium meliloti LMG 6133 T (X67222) Sinorhizobium kummermviae CCBAU 71714 T (AF364067) Sinorhizobium mediane A 321 T (L39882) L- Sinorhizobium arboris HAMBI1552 T (Z78204) j— Sinorhizobium kostiense HAMBI 1489 T (Z’8203)

I-Sinorhizobium terangae LMG 6463 T (X68387)

|—Sinorhizobium saheli LMG 783 ~ T (X68390) T. Sinorhizobium fredii ATCC35423 (DO1272) 51 Sinorhizobium xinjiangense lAM 14142 T (D12 796) -Bradyrhizobium japonicum DSM30131 T (X87272)

Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное на основе данных сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК бактерий рода Rhizobium c другими представителями Rhizobiaceaе c использованием алгоритма NJ. Масштаб соответствует 1 замене на 100 пар оснований (генетическим дистанциям). Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления (%), определенная с помощью «bootstrap»-анализа 1000 реплик. Значения «bootstrap» ниже 70% не показаны. Исследуемые штаммы относятся к роду, имеющему сокращение «R.»

-С

100

R.leguminosamm Ъ\ viciae 2486 R.leguminosamm b\ viciae Б-8 (its-L) R. legi/ in in osamm bv. viciae K-29 R.leguminosamm &v. viciae 31 (its-L)

• R. leguminosamm bv. viciae 96-st R.leguminosamm bi phaseoli ФН-6 (its-L) R.leguminosamm b\ phaseoli ФК-0 R.leguminosamm bv. pliaseoli ФН (its-L) R.leguminosamm bv. viciae 24Sa-st R.leguminosamm bv. trifoliiKK (its-L) R.leguminosamm b\ trifoliiКП012 (its-L) R.leguminosamm ln trifoliiКЛ91 (its-L) R.leguminosamm bv. viciae У-l (its-S) Rhkobium leguminosamm LMG14904 T (AF345271) R.leguminosamm bv. phaseoli 6S2 R.leguminosamm bv. trifolii 1326-st ■ R.leguminosamm 1n viciae 2616-st 1 R.leguminosamm bv. viciae Б-9 (its-L) -R.leguminosamm bv. phaseoli 105

■ R.leguminosamm b\ viciae Б-8 (its-S) J R.leguminosamm ln trifolii KK (its-S) |l R.leguminosamm bv. viciae 31 (its-S) I— R.leguminosamm bv. viciae 97-st

f- R. leguminosamm bv. viciae У-7 R.leguminosamm bv. tiifoiiiK~I91 (its-S) R.leguminosamm bv. trifoliiКПО12 (its-S) • R.leguminosamm bv. viciae Б-9 (its-S)

91_* Rhizobium gallicum R 602 T clone 1 (AF34S267)

96 П Rhizobium gallicum R 602 T clone 2 (AF345266)

I-Rhizobium mongolense USDA 1844 T (AF345273)

R.leguminosamm bv. phaseoli ФН-6 (its-S) q – R.leguminosamm bv. phaseoli ФА-4 П R.leguminosamm bv. phaseoli ФН (its-S) I – Rhizobium etli LMG 17827 T (AF.U1974) 9tI Rhizobium etli CUT 656 (NC 010994)

Rhizobium hainanense USDA 358S T (AF345269) Rhizobium tropici LMG 9503 T (A F3452 78) Rhizobium radiobacter LMG 140 T (AF541973) — Rhizobium rhizogenes DSM3014S T (AF345275)

■ Rhizobium tnsitanum PI-7 T (AY943641)

-Rhizobium tuuticola LMG 11875 T (AF345280)

.Rhizobium vitisLMG S’50 T (AF345279) -R.giartlinii ФС

■ Rhizobium gianliniiHI52 T (AF345268)

iool Rhizobium mbi DSM 6″72 T clone 2 (AF345277) ■ Rhizobium huautlense LMG 18254 T (AF345270) ■ R.galegae 926st П j

iool Rhizobium galegae LMG 6124 T (AF345265)

0.05

Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное на основе данных сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей ITS бактерий рода Rhizobium c использованием алгоритма NJ. Масштаб соответствует 5 заменам на 100 пар оснований. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления (%), определенная с помощью «bootstrap»-анализа 1000 реплик. Значения «bootstrap» ниже 70% не показаны. Исследуемые штаммы относятся к роду, имеющему сокращение «R.»

А. Б

Рис. 3. А. saAFLP-анализ с использованием эндонуклеазы рестрикции XmaЛ для бактерий рода И. leguminosarum. Буквами А и В на рисунке обозначены генотипы И. ^иттвБатт по ^¿п-региону (I класс);

Б. Амплификация ^¿п-региона исследуемых штаммов И. leguminosarum с использованием специфичных для бактерий рода Rhizobium праймеров. Буквами А и В на рисунке обозначены генотипы И. leguminosarum по h¿n-региону (I класс) Дорожки: 1 — маркер молекулярной массы 1кЬ, 2 — штамм 245 а, 3 — 248 б, 4 — 261 б, 5 — К-29, 6 — П-2, 7 — Г-8, 8 — Ч-14, 9 — 24, 10 — 28, 11 — 31, 12 — 32, 13 — 32-2, 14 — 34, 15 — 65, 16 — У-1, 17 — У-2, 18 — У-3, 19 — У-4, 20 — У-5, 21 — У-7, 22 — У-9, 23 — У-11, 24 — У-12

« ■■ I

тш **** »»у»

С D Е F G

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Рис. 4. Амплификация h¿n-региона с использованием специфичных для бактерий рода Rhizobium праймеров. Буквами на рисунке обозначены генотипы бактерий рода Rhizobium по h¿n-региону (табл. 1). Дорожки: 1 — маркер молекулярной массы 100-1000 п. о., 2 — И. leguminosarum 28, 3 — И. leguminosarum К-29, 4 — И. leguminosarum 261 б, 5 — И. leguminosarum ФК-0, 6 — И. leguminosarum 9681, 7 — И. leguminosarum 245а, 8 — И. leguminosarum У-9, 9 — И. leguminosarum КП15, 10 — И. leguminosarum У-7, 11 — И. leguminosarum МК, 12 — И. leguminosarum ФН,13 — И. leguminosarum ФН-6, 14 — И. giardinii ФС, 15 — И. вШ 70 081,16 — И. galegae К-3, 17 — маркер молекулярной массы 100 п. о.

Rhizobium (табл. 1). Полученные последовательности были выровнены с помощью программы CLUSTALW (Thompson et al., 1994) и сравнены с 5 нуклеотидными последовательностями штаммов Rhizobium sp., взятыми в базе данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI) США. Длина нуклеотидных последовательностей после выравнивания у различных

видов составила от 230 п. о. (И. вШ 926-81) до 650 п. о. (И. leguminosarum Ы. phaseoli 105). При этом все штаммы, за исключением представителей вида И.

и трех групп изолятов И. leguminosarum Ы. phaseoli, давали 3 продукта ПЦР-амплификации, что указывало на наличие 3 копий генов тРНК (Глю) (рис. 4).

На основании проведенного нами анализа 54 исследованных штамма были отнесены к трем биоварам: R. leguminosarum bv. viceae, R. leguminosarum bv. trifolii и R. leguminosarum bv. phaseoli. 1 штамм относился к виду R. etli 700st (V класс hin-региона) и 6 штаммов к R. galegae (VI класс hin-региона). По данным hin-регион ПЦР-изоляты из клубеньков гороха представляли собой 6 групп штаммов, а изоляты из клубеньков бобов — 2 группы, относящиеся к I классу hin-региона (рис. 5). Симбионты клевера были разделены на 5 групп штаммов I класса hin-региона, две из которых выделены из почв Украины (рис. 5), а изоляты из клубеньков фасоли принадлежали к пяти генетически удаленным группам: R. leguminosarum (генотипы A, B, b, C, D) и R. etli (генотип G) (V класс hin-региона). Таким образом, на исследуемой выборке штаммов рода Rhizobium, выделенных из различных эколого-геогра-фических зон Украины, было выявлено 7 генотипов, каждый из которых отличался длиной и ДНК-последовательностью hin-региона. Всего в исследуемой выборке штаммов по ДНК-последовательности hin-региона было выделено 8 генотипов (табл. 1).

Разделение исследуемой выборки штаммов на генотипы по последовательности hin-региона совпадало с группированием штаммов по saAFLP. Однако корреляции между растением-хозяином, происхождением штамма и генотипами обнаружено не было. Некоторые штаммы, объединенные в один генотип, являлись симбионтами различных биоваров растений (например, бобов и клевера — генотип B, гороха и фасоли — генотип А). Штаммы, выделяемые одновременно с одной и той же посевной площади (например, симбионты гороха Ула-довского района Херсонской области), представляли собой генетически удаленные по данным hin-регион ПЦР и saAFLP популяции, при этом большинство изолятов относились к генотипу А, что могло быть связано как с конкурентоспособностью штаммов данного генотипа, так и с численностью представителей этого генотипа в почве. Отсутствие данной корреляции было ожидаемым фактом, подтвержденным в исследованиях других ученых (Wernegreen et al., 1997). Оно связано с тем, что у бактерий рода Rhizobium все гены, определяющие его симби-отическую природу, как правило, находятся на плазмиде и способны переноситься от одного вида к другому, делая его сапрофитным или способным к симбиозу (Sullivan et al. 1995; Sullivan, Ronson, 1998). Мы же фокусируемся на изучении таксономической структуры рода, т. е. на изучении специфических генов и межгенных регионов хромосомной ДНК.

Далее, для выровненных секвенированных последовательностей hin-региона I класса R. leguminosarum был построен график, отражающий уровень ДНК-полиморфизма между тремя одноименными сайтами рестрикции AvrII со смещением 50-нуклеотидного окна с шагом в 1 п. о. (рис. 6). Исследования общего полиморфизма

нуклеотидных последовательностей на примере I класса hin-региона вида R. leguminosarum показали, что данный регион обладает высоким уровнем полиморфизма (до 15%) между штаммами разных биоваров. Таким образом, информативность предложенного нами локуса на два порядка выше, чем гена 16S рРНК, сопоставима по своей разрешающей способности с методом секвени-рования ITS и составляет 22 нуклеотидных замены на 100 п. о., что позволяет изучать бактерии на внутривидовом уровне.

Следует отметить, что полученные результаты для hin-региона коррелируют с результатами saAFLP и анализа сравнения нуклеотидных последовательностей 16S рРНК и ITS. Однако предложенный нами таксономический маркер обладает существенным преимуществом — он является хромосомным, обладает большей разрешающей способностью и представлен в геноме единичной копией. Таким образом, ПЦР-анализ hin-региона является достоверным диагностическим инструментом для изучения внутривидового генетического полиморфизма популяции клубеньковых бактерий рода Rhizobium.

По результатам проведенного анализа структуры hin-региона были выявлены специфические нуклео-тидные замены, в т. ч. протяженные вставки и делеции, характерные для видов и групп штаммов, выделенных c помощью анализа saAFLP. Эти данные позволят подбирать таксон специфичные праймеры отдельно на каждую группу штаммов, обладающих идентичной последовательностью hin-региона.

Рефераты: Дипломная работа: Изучение удовлетворенности трудом в отделении Контакт-центра -

заключение

Таким образом, нами была разработана маркерная система, специфическая для клубеньковых бактерий рода Rhizobium, позволяющая разделить их на уровне вида и группы штаммов (табл. 2). Родоспецифичная ПЦР hin-регионов позволяет идентифицировать бактерии рода Rhizobium, а определение их нуклеотидных последовательностей дает информацию о внутривидовом разнообразии. Применение же анализа hin-регионов совместно с другими методами, представленными в таблице 2, дает полную картину о таксономии рода Rhizobium на любом уровне.

Данные, полученные с помощью анализа hin-регио-нов, согласуются с результатами традиционных техник, рассмотренных выше, но значительно превосходят их по своей информативности. Так, на основании проведенных нами исследований при сравнительном анализе ДНК последовательностей hin-регионов было выявлено 8 генотипов ризобий, выделенных из различных эколого-географических зон Украины, Разделение штаммов на группы совпадало с филогенией, полученной по последовательности гена 16S рРНК, и группированием штаммов по результатам анализа saAFLP. Однако вариабельность

R. leguminosamm bv hifolii КП15 R. leguminosamm bv. hifolii КПО11 R. leguminosamm bv. hifolii КП012 R. leguminosamm bv. trifolii КЛ-91 R. leguminosamm bv. hifolii КЛ-90 R. leguminosamm bv. viceae E-17 R. leguminosamm bv. viceae Б-9 R. leguminosamm bv. viceae Б-16 R. leguminosamm bv. hifolii KK R. leguminosamm bv. viceae E-S R. leguminosamm bv. hifolii MK R. leguminosamm bv. viceae Б-6 R. leguminosamm bv. viceae Б-25 R. leguminosamm bv. viceae E-18 R. leguminosamm bv. viceae Б-15 R. leguminosamm bv. viceae У-7 731R. leguminosamm bv. viceae 2486

Пл. leguminosamm bv. viceae У-9 ili— R. leguminosamm bv viceae 245a-st

55I— Rhizobinm leguminosamm bv. hifolii WSM1325 (NC 012850)

чг

Rhizobinm etli 700-st

Rhizobinm etli CL4T652 (NC 010994)

-Rhizobinm leguminosamm bv. trifolii WSM2304 (NC_011S69)

R. leguminosamm bv. phaseoli 108″” R. leguminosamm bv. phaseoli 105 R. leguminosamm bv. phaseoli ФН R. leguminosamm bv. phaseoli ФК-0 – 1/b

R. leguminosamm bv. phaseoli 108 * – l b

R. leguminosamm bv. phaseoli ФК-6 – l b

R. leguminosamm bv. phaseoli ФК-4 – l b

Rhizobinm leguminosamm bv. viceae 3841 (NC_008380) • R. leguminosamm bv. viceae 96-st 1R. leguminosamm bv. viceae 97-st

-R. leguminosamm bv. viceae 2tilb-st

99 1Ä. leguminosamm bv viceae 31 Lä. leguminosamm bv viceae K-29

R. leguminosamm bv hifolii 1326-st R. leguminosamm bv. viceae У-1 R. leguminosamm bv viceae У-2 R. leguminosamm bv. viceae 32 R. leguminosamm bv. viceae 34 R. leguminosamm bv. viceae 65 R. leguminosamm bv. viceae 28 R. leguminosamm bv viceae У-5 R. leguminosamm bv. viceae У-11 R. leguminosamm bv phaseoli 682 R. leguminosamm bv. viceae 4-14 R. leguminosamm bv. phaseoli ФА-4 R. leguminosamm bv. viceae 24 R. leguminosamm bv viceae 32-2 R. leguminosamm bv. viceae П-2 R. leguminosamm bv phaseoli ФА-34 R. leguminosamm bv. viceae Г-8 R. leguminosamm bv. viceae У-12 R. leguminosamm bv phaseoli -Ф1 R. leguminosamm bv viceae У-3 R. leguminosamm bv. viceae У-4 ■ R. leguminosamm bv. phaseoli ФН-6

-R. giarHinii bv phaseoli ФС

R. galegae 913-st

R. galegae 926-st R. galegae K-18 R. galegae 916-st R. galegae 912-st R. galegae K-3

l/B

V/F

ll/C

l/B

l/A

lll/D IV/E

Vl/G

Рис. 5. Филогенетическое дерево, построенное на основе данных сравнительного анализа последовательностей hin-региона Rhizobium sp. c использованием алгоритма NJ. Масштаб соответствует 5 заменам на 100 пар оснований (генетическим дистанциям). Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления (%), определенная с помощью «bootstrap»-анализа (1000 реплик). Значения «bootstrap» ниже 70% не показаны

Рис. 6. График, построенный с помощью программного обеспечения DnaSP 5.10 (Rozas et al., 2021), показывает уровень полиморфизма hin-региона I класса для бактерий R. leguminosarum (по оси x указаны позиции среднего значения 50-нуклео-тидного скользящего окна, по оси y — S — число сегрегирующих сайтов). Hin-регион представляет собой суммарную нуклеотидную последовательность из Rt и R2. Специфические для рода Rhizobium праймеры обозначены PF и PR. Зелеными стрелками показаны гены тРНК (Глю)

нуклеотидной последовательности hn-регионов внутри отдельных генотипов была выше и составляла от 3,3 до 77,5% (по сравнению с 0,1-1,2% для 16S рРНК и 3,219,2% для saAFLP).

Хотя пока остается до конца неясным происхождение и значение hin-региона для ризобий, на основании проведенных исследований можно предположить, что он является необходимым для их жизнедеятельности. Известно, что данная последовательность, аналогов которой не найдено ни в одном секвенированном геноме про- и эукариот, располагается между повторами генов тРНК (Глю), которые, в свою очередь, являются предшественниками на начальной стадии биосинтеза тетрапирролов (гемоглобинов и хлорофилла) в растениях, археях и бактериях (Jahn et. al., 1992).

В клубеньках бобовых растений синтезируется ле-гоглобин (леггемоглобин, Lb), симбиотический гемоглобин, который играет первостепенную роль в процессе азотфиксации: способствует переносу кислорода в сим-биосомы, снабжая азотфиксирующих микросимбионтов связанным кислородом. С другой стороны, Lb выполняет буферные функции, связывая избыточный кислород, подавляющий каталитическую активность нитрогеназы (Топунов, Петрова, 2001; Космачевская, Топунов, 2009). Количество генов тРНК (Глю) и тип антикодона влияют на интенсивность биосинтеза Lb и возможность участия в биосинтезе других белковых соединений С5 метаболического пути (Levican et al., 2005).

Таблица 2

Разрешающая способность фенотипических и генетических методов, используемых в данной работе для изучения биоразнообразия бактерий рода Rhizobium

Метод Род Rhizobium Вид Био-вар Группа штаммов

Фенотипические методы

Биохимический анализ /- – –

Тест на инокуляцию растений-хозяев /- –

Генотипические методы

hin-регион ПЦР –

saAFLP –

ITS ПЦР-RFLP – /- – /-

секвенирование 16S рРНК – –

Секвенирование 16S-23S рРНК (ITS) –

Нами был проведен предварительный поиск наличия транскрипционных факторов и промоторных областей в данном регионе (Reese, 2001). По результатам исследования регион R2 содержал консервативную область длиной 46 п. о., которая со 100% вероятностью для растений и 90% вероятностью для бактерий являлась промотором, содержащим GATA-и GCGC-мотивы и необходимым для распознавания белковыми молекулами сигнальной (иммунной) системы растений. Исследования региона R1 не выявили характерных промоторных областей и мотивов, кроме TATA-бокса. Однако вторичная структура данного региона была аналогичной у всех классов ДНК-последовательностей R1 и образовывала двухшпилечную пространственную конформацию в позициях, примерно, —30 и -60 п. о.

Учитывая вышесказанное, можно предположить, что hin-регион является промотором генов тРНК (Глю), а его уникальная последовательность, возможно, является следствием совместной адаптации (эволюции) бактерий и растений-хозяев друг к другу.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ (12-04-01809), совместного гранта РФФИ (10-0490043 Бел_а) — БРФФИ (Б10 Р-211) и Целевой программы Президиума РАН «Поддержка молодых ученых» и Программе научных исследований НААН Украины «Научные основы управления микробиологическими процессами в технологиях высокопродуктивного сельскохозяйственного производства (Сельскохозяйственная микробиология)».

литература

1. Возняковская Ю. М., Попова Ж. П. 1985. Методические указания по идентификации неспоровых бактерий, доминирующих в ризосфере растений. Л.: ВНИИСХМ. 48 с.

2. Д1дович С. В., Толкачов М. З., Бутв1на О. Ю. 2008. Ефективнють симбютично! азотфксацп в агроценозах Укра!ни // Сшьськогосподарська мжробюлопя. Мiжвiдомчий тематичний наук. зб. 1СГМ УААН. Чернтв. Вип. 8. С. 117-125.

3. Зотов В. С., Пунина Н. В., Топунов А. Ф. Способ идентификации и дифференциаци и прокариотических организмов. Заявка на патент. Рег. № 2021135461 от 25.08.2021.

4. Космачевская О. В., Топунов А. 2009. Гемоглоби-ны — разнообразие структур и функций // Прикл. биохимия и микробиология. Т.45, № 6. С. 627653.

5. Методы почвенной микробиологии и биохимии. / Под ред. Звягинцева Д. Г. — М.: изд-во МГУ, 1991. 303 с.

6. Новикова Н. И. 1996. Современные представления о филогении и систематике клубеньковых бактерий // Микробиология, Т. 65, № 4. С. 437-450.

7. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Хоул-та Дж., Крига Н., Снита П.; перевод с англ., в 2 т. М.: Мир, 1997. 1232 с.

8. Топунов А. Ф., Петрова Н. Э. 2001. Гемоглобины: эволюция, распространение и гетерогенность // Успехи биологической химии Т. 41, С. 199228.

9. Altschul S. F, Gish W., Miller W. et al. 1990. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. Vol. 215. P. 403-410.

10. AmargerN, Macheret V., Laguerre G. 1997. Rhizobi-um gallicum sp. nov. and Rhizobium giardinii sp. nov., from Phaseolus vulgaris Nodules // Int. J. Syst. Bacte-riol. Vol. 47, No. 4. P. 996-1006.

11. Beringer J. E. 1974. R1 transfer in Rhizobium legumi-nosamm // J. Gen. Microbiol. 84:188-198.

12. Eardly B. D, Nour S. M., van Berkum P., Seland-er R. K. 2005. Rhizobial 16S rRNA and dnaK genes: mosaicism and the uncertain phylogenetic placement of Rhizobium galegae // App. and Env. Mic. Vol. 71. No. 3. P. 1328-1335.

13. Frank B. 1889. Ueber die Pilzsymbiose der Leguminosen // Ber Deut. Bot. Ges. Vol. 7. P. 332-346.

14. Gaunt M. W., Turner S. L., Rigottier-Gois L. et al, 2001. Phylogenies of atpD and recA support the small subunit rRNA-based classification of rhizobia // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. Vol. 51. P. 2037-2048.

15. Gurtler V. and Stanisich V. A. 1996. New approaches to typing and identification of bacteria using the 16S-23S rDNA spacer region // Microbiology. Vol. 142. P. 3-16.

16. Hall T. A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucl. Acids. Symp. Ser. Vol. 41. P. 95-98.

17. Jahn D, Verkamp E, Soll D. 1992. Glutamyl-transfer RNA: a precursor of heme and chlorophyll biosynthesis // Trends. Biochem. Sci. Vol. 17 (6). P. 215-223.

18. Kimura M. A. 1980. A simple method for estimating evolutionary rate at base substitudions through comparative studies of nucleotide sequences // J. Mol. Evol. Vol. 16. P. 111-120.

19. KumarS, TamuraK, NeiM. 2004. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment // Briefings in Bio-informatics. Vol. 5. P. 150-163.

20. Kwon S.-W, Park J.-Y, Kim J.-S. at al. 2005. Phylogenet-ic analysis of the genera Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium and Sinorhizobium on the basis of 16S rRNA gene and internally transcribed spacer region sequences // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. Vol. 55. P 263-270.

21. Laguerre G, Mavingui P., Allard M.-R. et al. 1996. Typing of Rhizobia by PCR DNA Fingerprinting and PCR-RFLP Analysis of Chromosomal and Symbiotic Gene Regions: Application to Rhizobium leguminosar-um and Its Different Biovars // App. and Env. Microbiol. Vol. 62. P. 2029-2036.

22. Lindstrom K. 1989. Rhizobium galegae, a new species of legume root nodule bacteria // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. Vol. 39. No. 3. P. 365-367.

23. Martinez E. 1994. Recent developments in Rhizobium genome // Plant and Soil, Vol. 161. P. 11-20.

24. Martínez-Romero E., Caballero-Mellado J. 1996. Rhizobium phylogenies and bacterial genetic diversity // Critical Rev. Plant Sci. Vol. 15. P. 113140.

25. Nei M, Kumar S. 2000. Molecular evolution and phy-logenetics. New York: Oxford University Press. P. 336.

26. Normand P., Cournoyer B., Nazaret S, Simo-net P. 1992. Analysis of a ribosomal operon in the actinomycete Frankia // Gene. Vol. 111. P. 119 — 124.

27. Palmer K. M, Young J. P. W. 2000. Higher Diversity of R. leguminosarum bv. viciae Populations in Arable Soils than in Grass Soils // App. and Env. Microbiol. Vol. 66. P. 2445-2450.

28. Reese M. G. 2001. Application of a time-delay neural network to promoter annotation in the Drosophila mel-anogaster genome // Computers & Chemistry. Vol. 26 (1). P. 51-56.

29. Rhizobiaceae. Молекулярная биология бактерий, взаимодействующих с растениями / Под ред. Спайнка Г., Кондороши А., Хукаса П. Пер. с англ. СПб.: Бионт, 2002. 558 с.

30. Sanger F, Air G.M, Barrell B. G. et al. 1977. Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA // Nature. Vol. 265. P. 687-695.

31. Segovia L, Young J. P. W, Martinez-Romero E. 1993. Reclassification of American Rhizobium legumi-nosarum biovar phaseoli type I strains in a new species, Rhizobium etli sp. nov // Int. J. Sys. Bacteriol. Vol. 43. P. 374-377.

32. Sullivan J. T, Patrick H. N, Lowther W. L, Scott D. B, Ronson C. W. 1995. Nodulating strains of Rhizobium loti arise through chromosomal and symbiotic gene transfer in the environment // Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 92. P. 8995-8999.

33. Sullivan J. T, Ronson C. W. 1998. Evolution of rhizobia by acquisition of a 500-kb symbiosis island that integrates into a phe-tRNA gene // Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 95. P. 5145-5149.

34. Suominen L, Roos C., Lortet G. et al., 2001. Identification and structure of the Rhizobium galegae common nodulation genes: evidence for horizontal gene transfer // Mol. Biol. Evol. Vol. 18. P. 907916.

35. Terefework Z., Kaijalainen S., Lindstrom K. 2001. AFLP fingerprinting as a tool to study the genetic diversity of Rhizobium galegae isolated from Galega orientalis and Galega officinalis // J. Biotechnol. Vol. 91. P. 169-180.

36. Terefework Z., Nick G., Suomalainen S., Padin L. 1998. Phylogeny of Rhizobiurn galegae with respect to other rhizobia and agrobacteria // Int. J. of Syst. Bacteriology. Vol. 48. P. 349-356.

37. Thompson J. D, Higgins D. G, Gibson T. J. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice // Nuc. Ac. Res. Vol. 22. P. 46734680.

38. Vandamme P., Pot B, Gillis M. et al., 1996. Poly-phasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics // Microbiol. Rev. Vol. 60. P. 407438.

39. Vessey J. K, Chemining’wa G. N. 2006. The genetic diversity of Rhizobium leguminosarum bv. viciae in cultivated soils of the eastern Canadian prairie // Soil Biology and Biochemistry. Vol. 38. P. 153-163.

40. Vinuesa P., Rojas-Jimenez K., Contreras-Moreira B. et al., 2008. Multilocus sequence analysis for assessment of the biogeography and evolutionary genetics of four Bradyrhizobium species that nodulate soybeans on the Asiatic continent // App. and Env. Mic. Vol. 74. P. 6987-6996.

41. Weisburg W. G., Barns S. M., Pelletier D. A., Lane D.J. 1991. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study // J. Bacteriol. Vol. 173. P. 697-703.

42. Wernegreen J. J., HardingE.E., Riley M. A. 1997. Rhizobium gone native: unexpected plasmid stability of indigenous Rhizobium leguminosarum // Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 94. P. 5483-5488.

43. Zotov V. S., Punina N. V., Ignatov A.N. et al. 2021. Elaboration and use of new approach to species and strain identification of phytopatological and nitrogen-fixing bacteria // Adaptation to Climate Change in the Baltic Sea Region: Contributions from Plant and Microbial Biotechnology. Program and Abstracts, Finland, P. 87.

THE NEW TAXONOMIC MARKER OF NODULATION BACTERIA OF RHIZOBIUM GENUS AND ITS EVOLUTION

Zotov V. S., Punina N. V., Khapchaeva S. A., Didovich S. V., Melnichuk T. N, Topunov A.F.

SUMMARY: The new taxonomic marker (hin-region) has been proposed, which gives possibility for Rhizobium bacteria study on

“species — group of strains” level. Using this marker the groups of Rhizobium strains were determined, which could not be distinguished with other methods, and these results correlated with evolutionary similarity of the bacteria. The developed approach for creating marker systems allows to carry out effective inventory of inter- and intra-species genetic diversity of nodulating bacteria and to evaluate perspectives of their use in agriculture. The proposed marker system was used for description of Rhizobium bacteria samples isolated from various ecological-geographical regions of Ukraine.

Ф KEY WORDS: Rhizobium; phylogeny; taxonomy; diversity; saAFLP; hin-region PCR; PCR-RFLP; 16S ribosomal RNA; 16S-23S ribosomal RNA.

Ф Сведения об авторах

Зотов Василий Сергеевич – младший научный сотрудник лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии им. А. Н. Баха РАН. 119071, Россия, Москва, Ленинский проспект, 33. E-mail: adni83@yandex.ru. Пунина Наталия Владимировна — к. б. н., научный сотрудник лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, научный сотрудник лаборатории ДНК-диагностики Медико-генетического научного центра РАМН. 119071, Россия, Москва, Ленинский проспект, 33. E-mail: hin-enkelte@yandex.ru.

Хапчаева Софья Арсеновна — старший лаборант лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии им. А.Н. Баха РАН. 119071, Россия, Москва, Ленинский проспект, 33. E-mail: hapchaeva90@mail.ru. Дидович Светлана Витальевна — к. с/х. н., старший научный сотрудник, заведующая лабораторией биологического азота и фосфора Отдела микробиологии Института сельского хозяйства Крыма Национальной академии аграрных наук Украины. 95453, Украина, АР Крым, г. Симферополь, ул. Киевская, 150. E-mail: sv-alex.68@mail.ru.

Мельничук Татьяна Николаевна — к.с/х.н., старший научный сотрудник, заместитель директора по науке Института сельского хозяйства Крыма Национальной академии аграрных наук Украины. 95453, Украина, АР Крым, г. Симферополь, ул. Киевская, 150. E-mail: melnichuk tn@ukr.net.

Топунов Алексей Фёдорович – д. б. н., руководитель лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии им. А. Н. Баха РАН. 119071, Россия, Москва, Ленинский проспект, 33. E-mail: aftopunov@yandex.ru.

Vasily Sergeevich ZOTOV — junior research scientist, Laboratory of Laboratory of biochemistry of nitrogen fixation and nitrogen metabolism, A.N. Bach Institute of Biochemistry, Russian Academy of Sciences. E-mail: adni83@yandex.ru. Natalia Vladimirovna PUNINA — Ph.D., research scientist, Laboratory of biochemistry of nitrogen fixation and nitrogen metabolism, A.N. Bach Institute of Biochemistry, Russian Academy of Sciences; research scientist, Laboratory of DNA diagnostics, Research Centre for Medical Genetics, Russian Academy of Medical Sciences. E-mail: hin-enkelte@yandex.ru.

Sofia Arsenovna KHAPCHAEVA — senior technician, Laboratory of biochemistry of nitrogen fixation and nitrogen metabolism, A.N. Bach Institute of Biochemistry, Russian Academy of Science. E-mail: hapchaeva90@mail.ru.

Svetlana Vitalievna DIDOVICH — Ph.D., senior research scientist, head of laboratory, Laboratory of biological nitrogen and phosphorus, Department of Microbiology, Institute of Agriculture of Crimea of National Academy of Agriculture Sciences of Ukraine. E-mail: sv-alex.68@mail.ru.

Tatiana Nikolaevna MELNICHUK — h.D., senior research scientist, Deputy Director on science, Institute of Agriculture of Crimea of National Academy of Agriculture Sciences of Ukraine. E-mail: melnichuk tn@ukr.net.

Alexey Fedorovich TOPUNOV – D.Sc., head of laboratory, Laboratory of biochemistry of nitrogen fixation and nitrogen metabolism, A.N. Bach Institute of Biochemistry, Russian Academy of Sciences. E-mail: aftopunov@yandex.ru.

Экзополисахариды морских бактерий: перспективы применения в медицине

Н. Н. БЕСЕДНОВА’, Т. П. СМОЛИНА’, Б. Г. АНДРЮКОВ’, Т. А. КУЗНЕЦОВА’, В. В. МИХАЙЛОВ2, Т. Н. ЗВЯГИНЦЕВА2

‘ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова, Владивосток 2 Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г. Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток

Exopolysaccharides of Marine Bacteria: Prospects for Use in Medicine

N. N. BESEDNOVA’, T. P. SMOLINA’, B. G. ANDRYUKOV’, T. A. KUZNETSOVA’, V. V. MIKHAILOV2, T. N. ZVYAGINTSEVA2

‘ Somov Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok 2 G. B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Vladivostok

В обзоре представлены основные направления биомедицинских исследований, посвящённых экзополисахаридам (ЭПС), полученным из различных видов морских бактерий. ЭПС — высокомолекулярные полимеры, состоящие из остатков сахаров и отличающиеся большим разнообразием структуры, что обусловливает их уникальные биологические свойства. Приведены многочисленные данные, касающиеся антиоксидантной, иммуномодулирующей и противоопухолевой активности ЭПС. Особое внимание обращается на противовирусное, антибактериальное и ингибирующее действие ЭПС на формирование биоплёнок. С учётом широкого спектра фармакологической активности и низкой токсичности эти соединения привлекают к себе внимание в качестве потенциального источника лекарственных субстанций.

Ключевые слова: морские бактерии, экзополисахарид, антиоксидант, иммуномодулятор, противоопухолевая активность.

The review presents the main directions of biomedical research on exopolysaccharides (EPS) obtained from various species of marine bacteria. EPS are high molecular weight polymers consisting of sugar residues; they are characterized by a large variety of structures, which causes unique biological properties. Numerous data on antioxidant, immunomodulatory, and antitumor activity of EPS are presented. Particular attention is drawn to the antiviral, antibacterial, and inhibitory effect of EPS on the formation of biofilms. Taking into account the wide spectrum of pharmacological activity and low toxicity, these compounds have attracted attention as a potential source of medicinal substances.

Keywords: marine bacteria, exopolysaccharide, antioxidant, immunomodulator, antitumor activity.

Человечество с давних времен стремилось использовать сырьевое богатство Океана, в том числе и в качестве источника новыгх лекарств. За последние 50 лет бышо получено более 25000 новыгх соединений из морских организмов, при этом прирост их числа составил около 5% в год [1]. Более 90% океанической биомассы морей и океанов составляют микроорганизмы, включая микроводоросли. Микроорганизмы являются важной составной частью морских экосистем. Ещё сравнительно недавно среди исследователей была распространена точка зрения о прокариотах как о микроорганизмах, попавших в море со стоками рек или в результате эолового переноса (перенос песчаных и пылевыгх частиц ветром). На самом деле экосистемы океана, являясь древнейшими на земле, имеют отличную от суши микробиоту [2, 3]. Экстремальные условия

Адрес для корреспонденции: 690087 Владивосток, ул. Сельская, д. 1. НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова

существования морских микроорганизмов в условиях низких или высоких температур, высокого давления и отсутствия света привели к развитию у них уникального метаболизма. В настоящее время морские микроорганизмы рассматриваются как источник необычных по химическому строению природных соединений, обладающих богатейшим фармацевтическим потенциалом [2—5].

Микроорганизмы океанов составляют примерно половину первичной продукции органических веществ на Земле [6], и важное место среди них занимают экзополисахариды (ЭПС) — высокомолекулярные полимеры, состоящие из остатков сахаров, которые секретируются микроорганизмами в окружающую их среду и могут служить барьером между клетками и окружающей средой, а также для прикрепления к твёрдым поверхностям. Эти соединения отличаются большим разнообразием структурных комбинаций, обусловливающих уникальные индивидуальные биологические свойства.

Бактерии, продуцирующие ЭПС, постоянно присутствуют в морских экосистемах и могут быть выделены из толщи воды, донных отложений, от представителей морской флоры и фауны и т. д. [7]. Эти соединения привлекают к себе внимание в качестве потенциального источника лекарственных субстанций, поскольку они часто не токсичны, обладают иммуномодулирующим, ан-тиоксидантным, противовоспалительным, антимикробным, антибиоплёночным действием.

ЭПС выделяют из различных морских бактерий: Bacillus, Holomonas, Planococcus, Enterobacter, Alteromonas, Pseudoalteromonas, Vibrio, Rhodococcus и др. К настоящему времени в этом отношении лучше изучены виды родов Pseudoalteromonas, Alteromonas и Vibrio [8]. ЭПС морских бактерий представляют собой капсульный полисахарид, ковалентно связанный с поверхностью бактериальной клетки, либо полисахариды слизи, не связанные или слабо связанные с поверхностью клетки, либо высвобождающиеся в окружающую среду [5, 9].

В соответствии со структурой ЭПС подразделяются на гомо-, гетерополисахариды, а также полисахарида: с нерегулярной структурой. Различные типы неорганических и органических заместителей (сульфаты, фосфаты, ацетаты, простые эфиры, аминокислоты, лактаты, пируваты) могут включаться в гомополисахариды, которые могут быть разветвлёнными или линейными [7, 10].

По источнику получения ЭПС можно разделить на природные и полусинтетические, получаемые путём химической или ферментативной модификации исходных макромолекул [11]. Молекулярная масса полисахаридов варьирует от 50 до нескольких тысяч kDa.

Экзополисахариды морских бактерий выгодно отличаются от полисахаридов из наземных бактерий, растений и водорослей тем, что для морских бактерий можно создать определённые воспроизводимые контролируемые параметры производства, в результате чего исключается экологическое воздействие и достигается высокое качество конечного продукта [12]. В последние годы исследования большинства учёных нацелены на изучение ЭПС из экстремофилов. Считается, что поскольку эти микробы выживают в сложных условиях высыхания, высокой или низкой температуры, высокого атмосферного давления, то следует ожидать от ЭПС, полученных из них, уникальных свойств [13]. К таким микроорганизмам относятся, например, Alteromonas macleodii subsp. fijiensis, Vibrio diabolicus, Alteromonas и др.

Микробные ЭПС нашли применение в медицине с середины XX века. Так, тестирование нескольких тысяч штаммов морских микроорганизмов позволило установить, что наиболее распространёнными среди метаболитов микроорганиз-

мов, в том числе и среди ЭПС, являются противоопухолевые соединения, что отличает морские организмы от почвенных и пресноводных. Среди метаболитов обнаружены также соединения с иммуномодулирующими, противовоспалительными, противовирусными и противобактериаль-ными свойствами [2].

Потребность в новых лекарствах — важнейший вопрос для медицины, который можно в определённой степени разрешить путём инновационных технологий, связанных с морскими организмами. Разработка систем с контролируемой доставкой лекарственных средств, а также микро- и наночастиц открыла новую эру в использовании ЭПС и их производных, поскольку эти соединения являются нетоксичными, биоразлагае-мыми, в связи с чем могут служить эффективной основой для разработки лекарственных препаратов, а также вакцинных адъювантов [14].

Рефераты: Методы выявления основной тенденции (тренда) в рядах динамики

В настоящем сообщении мы не будем останавливаться на промышленном использовании ЭПС из морских бактерий (в пищевой, бумажной, текстильной, нефтяной промышленности, в области экологии и пр.) [15]. Целью данной работы является обзор литературных сведений последних лет, касающихся возможности использования ЭПС морских бактерий в медицине, а также достижений в этой области.

Антиоксидантное действие экзополисахаридов из морских бактерий. Антиоксидантная активность — одна из важнейших характеристик биологически активных соединений, поскольку окислительный стресс сопровождает многие инфекционные и неинфекционные болезни. Окислительные процессы являются также одной из причин порчи пищевых продуктов и косметических средств.

В последние десятилетия опубликовано большое количество работ, свидетельствующих о высоком антиоксидантном потенциале ЭПС из морских бактерий [16, 17]. Так, S. Wu et al. [17] установили наличие выраженной антиоксидантной активности за счёт гашения гидроксильных и супероксидных анион-радикалов у экзополисахарида EPS273, полученного из супернатанта морской бактерии Pseudomonas stutzeri 273. Полисахарид состоял из глюкозамина (35,4%), рамнозы (28,6%), глюкозы (27,2%) и маннозы (8,7%). Молекулярная масса соединения составляла около 190 kDa.

Известно, что гидроксид-радикал является весьма сильным окислителем и практически не участвует в образовании других активных форм кислорода, но является важным фактором окислительной модификации многих клеточных структур [18]. Он может окислять молекулы белков и липидов, особенно активно атакуя мембранные липиды, которые содержат ненасыщенные двойные связи. Этот процесс приводит к об-

разованию липидных гидроперекисей и изменению свойств клеточныгх мембран. Гидроксид-ра-дикал вы:зы:вает разрыш связей в молекуле ДНК, что может привести к глубоким повреждениям генетического аппарата клеток. Полисахарид EPS273 при концентрации 60 мкг/мл нейтрализовал до 50% гидроксид-радикалов, концентрация которых намного превышала концентрацию полисахарида.

Супероксид анион является ключевой активной формой кислорода. Он представляет опасность тем, что способен повреждать белки, содержащие железо-серные кластеры (например, сук-цинатдегидрогеназу, оксиредуктазу и др.). EPS273 нейтрализовал около 60% супероксид анионов при концентрации 60 мкг/мл. Авторы представляют это соединение в качестве сильного антиокси-данта, который может найти применение в медицине и пищевой промышленности.

M. S. Mohsen et al. [19] исследовали проявления оксидативного стресса при болезни Альцгей-мера. При этой патологии происходит интенсивная генерация активных форм кислорода, что связано с нарушениями тканевого дыхания митохондрий, а также с воспалительной реакцией ми-кроглии [20]. В связи с этим агенты, предотвращающие окислительный стресс, могут быть особенно эффективны при лечении болезни Альц-геймера. Авторы применили с этой целью EPS из Achromobacter piechaudii, действующий в качестве ингибитора на COX-1, COX-2, и на холинэстера-зу. В состав EPS входили арабиноза, ксилоза, фруктоза и галактуроновая кислота в соотношении 4,5:4,0:1,0:0,3, соответственно, его молекулярная масса составляла 5,67х 103 г/моль.

Ингибирующий эффект по отношению к COX-2 составил от 21 до 92%, к COX-1 – от 7,77 до 36,22%. Для препарата сравнения (целекокси-ба) эти показатели составили: для COX-2 — от 28 до 100% и для COX-1 — от 6,11 до 34,12%. Инги-бирующая активность по отношению к холинэс-теразе была от 12,36 до 38,35%. Эти эффекты сопровождались значительным антиоксидантным действием (показатель IC50 в мкг/мл для DPPH (diphenyl-picrylhydrazyl) составил 170±1,01, для O2 — 199,3 0,88, для H2O2 — 205,12 1,21, хелати-рования железа — 100,80 0,89, общей антиокси-дантной активности — 73,58 1,41).

Как бышо описано ранее [21], кислые полисахариды содержат больше уроновыгх кислот и обладают более высокой активностью по удалению радикалов. На антиоксидантную активность полисахаридов могут влиять также пространственная структура, величина молекулярной массы, характер гликозидных связей, разветвления от основной цепи [22]. Всё это свидетельствует о многофакторности антиоксидантного действия ЭПС. Авторы рекомендуют разработанный ими

ЭПС для лечения и/или профилактики в будущем болезни Альцгеймера.

Морские организмы, которые подвергаются воздействию высоких уровней ROS (reactive oxygen species) в океане, продуцируют антиоксиданты в качестве защиты тканей от повреждений, вызванных окислительным стрессом. Определённый вклад в эту защиту вносят микроорганизмы, обитающие на/в этих гидробионтах. Так, P. Priyanka et al. [23] исследовали антиоксидантную активность трёх ЭПС, полученных из бактерий, ассоциированных с морскими организмами (водорослями и беспозвоночными животными), которые были идентифицированы как Alteromonas sp. PRIM-21 (содержал 2% сульфата), Nitratireductor sp.PRIM-24 (содержал 2% сульфата) и Enterobacter sp. PRIM-26 (несульфатированный полисахарид). Все ЭПС, полученные из этих микроорганизмов, обладали антиоксидантной активностью, наиболее высокой у PRIM-26 в отношении супероксида (IC50 0,33 мг/мл-1) и DPPH (IC50 0,44 мг/мл-1). Авторы рекомендуют эти полисахарида: для дальнейших биотехнологических исследований.

Морские бактерии являются неисчерпаемым источником новых ЭПС, обладающих антиокси-дантными свойствами. Свидетельством этого является, например, и тот факт, что метаболиты большинства морских прокариот, в частности, пигментированных бактерий, обитающих на морских водорослях, как правило, обнаруживают антиокси-дантные эффекты [24]. Таким образом, получение новых эффективных антиоксидантов из морских бактерий — перспектива ближайшего будущего.

Иммуномодулирующее действие ЭПС морских микроорганизмов. Распознавание микробов является основополагающим компонентом иммунного ответа, включая воспалительную реакцию. Этот ответ опосредуется рецепторами особого семейства, узнающими общие молекулярные компоненты и получившими название PRR (рattern recognition receptors). После узнавания соответствующего специфического паттерна PRR запускают серию сигнальных каскадов, представляющих первую линию обороны организма от микробов. Инициированный PRR сигнал включает созревание дендритных клеток, подготавливающих формирование адаптивного иммунитета. Первыми идентифицированными PRRs были Toll-like рецепторы (TLRs), опосредующие распознавание молекулярных структур патогенов. Они экспрес-сируются на клетках разных типов, инициируя развитие иммунных реакций при связывании с различными лигандами.

В последнее десятилетие появляется всё больше работ, касающихся модулирующего действия полисахаридов морских бактерий на иммунную систему позвоночных, благодаря их способности изменять функциональное состояние антиген-

презентирующих клеток (макрофагов, дендритных клеток). В связи с этим представляет интерес работа M.-H. Lin et al. [25], в которой представлены результаты исследования действия ЭПС, полученного из биоплёнки микроорганизма Thermus aquaticus YT-1 — грамотрицательной палочковидной бактерии. В отличие от типичных грамотри-цательных бактерий, она не имеет липополисаха-рида во внешней мембране, что, по-видимому, исключает токсичность соединения. Микроорганизм живет в горячих источниках, гейзерах. Бактерии растут при температуре от 50 до 85°С. ЭПС этих бактерий построен из повторяющихся тетра-сахаридных звеньев, состоящих из галактофура-нозы, галактопиранозы и N-ацетилгалактозамина (1:1:2). Кислые сахара в ЭПС отсутствовали. Авторы исследовали влияние ЭПС из этого микроорганизма на функциональную активность макрофагов линии RAW 264.7 и продукцию цитокинов. Из неочищенного ЭПС путём гельфильтрации была получена фракция (ТА-1), для которой был показан дозозависимый эффект на продукцию макрофагами TNFa и IL-6 — провоспалительных цитокинов. Определяли также продукцию макрофагами NO. Было установлено, что ЭПС индуцировал продукцию цитокинов и NO при взаимодействии с TLR2 и что именно TLR2 отвечал за активацию NF-kB. Таким образом, фракция ЭПС ТА-1, выделенная из T.àquaticus, обладала имму-норегуляторной активностью по отношению к макрофагам, играющим значительную роль в инициировании адаптивных иммунных реакций.

Также эффективными модификаторами биологического ответа являются ЭПС из других бактерий — антарктической психрофильной бактерии Psychrobacter sp. [26] и антарктической бактерии Pseudoalteromonas sp. [27]. Авторы [26] определяют ЭПС из Psychrobacter sp. как агонист TLR4. Полисахариды усиливали фагоцитарную активность макрофагов, продукцию ими NO и секрецию провоспалительных цитокинов TNFa и IL-1/3.

Система комплемента участвует в защите организма от бактериальных инфекций и в устранении клеток опухолей. A. Courtois et al. [28] исследовали влияние двух ЭПС из морских бактерий на систему комплемента. Первый ЭПС (GY785) представлял собой высокомолекулярный (до 106 Da), разветвлённый сульфатированный полисахарид, полученный из глубоководной морской бактерии Alteromonas infernus Второй ЭПС (HE800) — гликозаминогликан, полученный из Vibrio diabolicus, имеющий линейную основу и молекулярную массу около 8х105 Da. Ранее было показано, что этот ЭПС положительно влияет на регенерацию кожи и кости [29]. Высокомолекулярные полимеры деполимеризовали для снижения вязкости соединений и усиления их взаимодействия с потенциальными рецепторами или

лигандами. Было доказано взаимодействие между модифицированными ЭПС и белком СЦ системы комплемента. Результаты показали, что оба полисахарида дозозависимо активировали классический путь системы комплемента

Движение нейтрофилов и моноцитов — одних из главных эффекторных клеток врождённого иммунитета — в очаг воспаления начинается с серии адгезионных событий, каждое из которых связано с изменением экспрессии определённого типа поверхностный молекул. В работе Т. П. Смолиной и соавт. [30] показано, что ЭПС морской бактерии Pseudoalteromonas nigrifaciens значимо снижал экспрессию Ь-селектинов (СБ62Ь), но увеличивал экспрессию в-интегринов (СБ11Ъ, СБ11с) и иммуноглобулинов (СБ54) на нейтрофилах и моноцитах. Действие ЭПС P.mgrifaaens на изменение уровня экспрессии молекул адгезии нейтрофилов и моноцитов проявлялось уже через 1 ч инкубации. Таким образом, ЭПС оказышал активирующее действие на эффекторные функции клеток врождённого иммунитета, т. к. молекулы адгезии, относящиеся к селектинам и интегринам, играют специализированную роль в процессе таксиса лейкоцитов в участок воспаления и передаче раз-личныгх клеточныгх сигналов, а молекулы СБ54 обеспечивают адгезию нейтрофилов и моноцитов к сосудистому эндотелию с последующей их экс-травазацией и миграцией в очаг воспаления. Кроме того, ЭПС, выщеленный из P.mgrifaaens, увеличивал относительное количество моноцитов, синтезирующих 1Ь-12, и повышал цитотоксический потенциал МК-клеток, усиливая их дегрануляцию (экспрессию мембранного СБ 107а), внутриклеточный синтез №N-7 и увеличивая экспрессию молекул СБ25, СБ69, НЬЛ-БЯ, СБ11Ъ и СБ54 [31]. В связи с тем, что МК-клеткам принадлежит важнейшая роль в иммунологическом надзоре, а ЭПС морских бактерий P.nigrifaciens являются индукторами МК-клеточной активности, представляется перспективным дальнейшее исследование этих гликополимеров и создание на их основе фармакологических противовирусных и противоопухолевых препаратов.

Противоопухолевые эффекты ЭПС. Онкологические заболевания являются второй из основных причин смерти во все мире. Ежегодно болезнь уносит свыше 12 млн человек. Значительную часть этого бремени (около 63%) несут страны с низким и средним уровнем дохода [16, 32]. Ожидается, что в ближайшие 20 лет число новых заболевших возрастёт примерно на 70%. Применяемые в настоящее время противоопухолевые препараты отличаются от других лекарств высокой агрессивностью и сильным местно-раздра-жающим действием, в связи с чем ведётся поиск новых эффективных соединений с минимальным побочным действием.

В последние десятилетия достаточно интенсивно исследуются противоопухолевые свойства ЭПС из морских бактерий как свободноживу-щих, так и ассоциированных с другими гидроби-онтами. Полученные к настоящему времени результаты вселяют надежду на то, что ЭПС морских бактерий послужат основой для создания новых лекарственных препаратов с минимальными побочными эффектами.

До настоящего времени не разработаны методы блокирования процесса метастазирования. Так, быстрым метастазированием отличается не-мелкоклеточная карцинома лёгких [33]. В этом вопросе необходимы новые терапевтические стратегии и новые агенты, которые бы действовали на процесс перемещения раковых клеток из места образования опухоли в другие части организма. В связи с этим представляет интерес работа R. Cao et al. [34]. Авторы использовали в экспериментах ЭПС11 из морской бактерии Bacillus sp., изолированной из морских донных отложений, и клеточную линию А549 (клетки карциномы лёгкого).

Аноикис — апоптоз, обусловленный нарушением связи клеток с экстрацеллюлярным матрик-сом, в связи с чем усиление этого процесса может быть новой перспективной стратегией борьбы с метастазированием [35]. ЭПС 11 индуцировал аноикис путём подавления экспрессии III-тубу-лина и влиял на пролиферацию и адгезию культуры клеток. Полисахарид дозозависимо разрушал нитевидные структуры (филоподии) опухолевых клеток. Филоподии — длинные тонкие выступы, помогающие здоровым клеткам перемещаться внутри ткани. В раковых клетках эти органеллы появляются в избытке, обеспечивая их адгезию, миграцию и инвазию [36, 37]. Число филоподий определяет инвазивность опухолевых клеток [38]. ЭПС11 ингибировал миграцию опухолевых клеток, разрушая филоподии. Другим механизмом противоопухолевого действия полисахарида было ингибирование III-тубулина, экспрессия которого связана с развитием агрессивного клеточного фенотипа, устойчивого к аноикису и окси-дативному стрессу. Этот же полисахарид эффективно ингибировал процесс метастазирования клеток остеосаркомы в лёгкие [34]. Жизнеспособность опухолевых клеток после инкубации с ЭПС11 составила 55% при дозе 100 мкг/мл, 72% — при 50 мкг/мл, 79% — при 25 мкг/мл и 82% — при 12,5 мкг/мл. Авторы установили, что для проявления противоопухолевого действия в основной цепи глюкана необходимы ß-(1^3) связи и дополнительные ß-(1^6) точки ветвления. Таким образом, ЭПС 11 является перспективным кандидатом для разработки противоопухолевых лекарственных препаратов.

На модели опухолевых клеток MCF-7 (адено-карцинома молочной железы человека) была ис-

следована эффективность ЭПС из Bacillus mari-nus, выделенной из морских донных отложений [16]. Молекулярная масса основной фракции полисахарида составляла 500 KDa, моносахаридный состав соединения был представлен глюкозой и глюкуроновой кислотой в молярном соотношении 3:1, соответственно, соединенных ß-(1^4) связями. Химическая структура полисахарида выглядела следующим образом: [Glc-ß-(1^4)-Glc-e-(1^4)-Glc-e-(1^4)-GlcA]n.

Другие авторы связывают противоопухолевое действие морских ЭПС с их мощным антиокси-дантным и противовоспалительным потенциалом [39]. Авторы исследовали противоопухолевое действие полисахарида из Bacillus amyloliquefa-ciens 3MS2021, выделенной из морских донных отложений. Кислый ЭПС содержал 12,3% уроно-вых кислот. Молекулярное соотношение глюкозы, галактозы и глюкуроновой кислоты составляло 1,6:1,0:0,9, соответственно. В качестве модели были использованы клеточные культуры MCF7 (аденокарцинома молочной железы человека), PC3 (рак предстательной железы человека), а также асцитной карциномы Эрлиха (EAC). ЭПС оказал сильное избирательное ингибирующее действие на клетки рака молочной железы (65,2% погибших клеток при IC50=70 мкг/мл и IC90=127,4 мкг/мл). Мощный эффект отмечен на клетках EAC. В данном случае воздействие ЭПС привело к гибели 81,77 0,75% клеток при 2,80 0,95% в контроле. Авторы связывают значительный противоопухолевый эффект, во-первых, с мощным антиоксидантным действием ЭПС и, во-вторых, с противовоспалительным действием (ингибирование экспрессии NO2 и COX2, в меньшей степени — COX-1).

Остеосаркома — злокачественная опухоль костей сопровождается частым метастазированием в лёгкие. D. Heymann et al. [40] провели исследование противоопухолевого эффекта по отношению к остеосаркоме трёх высокосульфатирован-ных производных ЭПС с различной молекулярной массой (4,8 и 15 kDa). Исходный полисахарид GY785EPS был получен из глубоководной гидротермальной бактерии Alteromonas infernus [41, 42]. Содержание серы в производных исходного полисахарида составляло свыше 10%. На клеточных линиях остеосаркомы было установлено, что только производное EPS15kDa ингибировало ин-вазивность клеток остеосаркомы, но не оказывало влияния на клеточный цикл. Это же производное было мощным ингибитором миграции клеток остеосаркомы, незначительно увеличивало уровень ММР-9 и более высоко — тканевой ингибитор TMP-1. В экспериментах in vivo соединение значимо ингибировало образование метастазов в лёгких мышей. При ретроорбитальной инъекции мышам клеток мышиной остеосаркомы,

обработанных EPS15kDa, у животных снижалось количество метастазов и было на 40% меньше, чем у мышей, которым вводили необработанные полисахаридом клетки опухоли или обработанные гепарином клетки. Выживаемость животных, получивших обработанные полисахаридом клетки, составила 70%, в то время, как в контрольной группе выжило только 14% животных (срок наблюдения составил 69 дней).

C. Ruiz-Ruiz et al. [43] получили ЭПС из гало-фильной бактерии Halomonas stenophila (штамм В100). Авторы позиционируют это соединение в качестве полисахарида, оказывающего сильное избирательное проапоптотическое действие на Т-клетки линии лимфобластной лейкемии. Нормальные Т-клетки были резистентны к действию полисахарида. Клетки, выделенные из крови пациента с лейкемией, были чувствительны к индуцированному полисахаридом EPSB100 апоптозу. В связи с получением таких результатов авторы предлагают провести скрининг среди ЭПС гало-фильных бактерий для выявления наиболее сильных индукторов апоптоза лейкемических клеток.

Наиболее распространённой первичной злокачественной опухолью печени является гепатоцел-люлярная карцинома. S. M. Abdelnasser et al. [44] получили новый низкомолекулярный EPS-6 из Bacillus megaterium (донные отложения в Средиземном море), высокотоксичный (IC50=218 мкг/мл) для клеток гепатоцеллюлярной карциномы Hep-2. Такую высокую токсичность авторы объясняют наличием в структуре полисахарида сульфатов и уроновых кислот.

Приведённые материалы свидетельствуют о значительном противоопухолевом потенциале экзополисахаридов морских бактерий.

Противовирусное действие ЭПС из морских бактерий. Невысокая эффективность традиционных методов терапии вирусных инфекций диктует необходимость поиска новых препаратов, не только способствующих регуляции функций иммунной системы, но и избирательно воздействующих на процессы репликации вируса. В связи с этим в разных странах проводятся исследования противовирусных свойств природных полисахаридов, в том числе и ЭПС морских бактерий [45, 46].

Морские ЭПС могут либо ингибировать репликацию вируса воздействием на его жизненный цикл на разных этапах, либо усиливать антивирусный иммунный ответ хозяина для ускорения процесса элиминации возбудителя. Большие надежды в этом плане возлагают на ЭПС, полученные из бактерий экстремофилов, поскольку они способны производить новые неизвестные метаболиты, которые, как полагают, могут иметь уникальные характеристики (необычный химический состав, физико-химические свойства, струк-

туру), иной механизм действия, чем существующие противовирусные препараты.

В качестве моделей для изучения противовирусных свойств ЭПС часто используют вирусы семейства Herpesviridae (HSV), имеющие высокую социальную значимость, что определяется не только широким распространением герпесвирус-ной инфекции и уровнем летальности, но и особенностями патогенеза и разнообразием клинических проявлений. Герпесвирусы избегают воздействия иммунной защиты организма. Поэтому пути поиска новых противовирусных препаратов связаны не только с разработкой эффективных химических соединений, но и с определением иммунологических мишеней для стимуляции клеточного иммунитета.

Такие природные ЭПС (A1 и A2) и их производные были получены M. Ма18иёа et al. [47] из морских бактерий Pseudomonas sp. WAK-1, выделенных из бурой водоросли Undaria pinnatifida. Молекулярная масса А1 и А2 составляла 26 и 100 kDa, соответственно. В состав производных А1 и А2 — A1S и A2S — входили компоненты GalNAc : GlcUA : пируват: сульфат в молярном соотношении 3:1:0,5:7 и галактоза:глюкоза:сульфат в молярном соотношении 2:1:10, соответственно. ЭПС А1 и А2 не обладали противовирусной активностью по отношению к ВИЧ-1. ЭПС А2 защищал клетки от HSV-2. Кроме того, оба производных обладали активностью по отношению к вирусу гриппа, сравнимой с таковой рибавирина.

Несколько позже A. Arena et al [45] выделили ЭПС из бактерий Bacillus lichineformis, полученных из воды горячего морского источника. Добавление к мононуклеарным клеткам периферической крови человека этого ЭПС (характеристика которого представлена в работе B. Nicolaus et al. [48]) приводило к снижению репликации вируса HSV-2 в клетках. Так, в присутствии ЭПС в дозах 300, 200 и 100 мкг/мл отмечено 3х104 PFU/ml (бляшкообразующие единицы/мл), 8 х 104 PFU/ ml и 1,7х 105 PFU/ ml, соответственно. В необработанных клетках этот показатель составил 2х 105 PFU/ ml. В обработанных ЭПС клетках отмечен высокий уровень продукции цитокинов: IFNy, IL-12, IFNa, TNFa, IL-18, IL-4.

С. Gugliandolo et al. [46] было исследовано противовирусное действие ЭПС, полученных из B.lichinifomis (штамм E-14) и Geobacillus thermod-enitrificans B3-72 и B3-15. Второй штамм был более термофильным, оптимум роста — 65°С. ЭПС препятствовали репликации HSV-2 в мононукле-арных клетках периферической крови человека, но не в линии клеток WISH (Wistar Institute Susan Hayflic), что указывает на то, что в механизмах противовирусной активности участвует клеточный иммунитет. Все ЭПС индуцировали высокий уровень продукции клетками периферической

крови человека цитокинов Thl-типа, тогда как продукция цитокинов ТШ-типа не увеличивалась. Эти ЭПС способны стимулировать иммунный ответ и тем самым усиливать противовирусную иммунную защиту, действуя как иммуномо-дуляторы. В связи с этим авторы полагают, что в будущем эти ЭПС можно будет применять при вирусной инфекции у иммунокомпрометирован-ных лиц. Приведённые примеры свидетельствуют о том, что ЭПС из морских бактерий способны ингибировать репликацию HSV-2 путём увеличения экспрессии специфических противовоспалительных цитокинов, а также поляризации иммунного ответа в направлении Thl. Переключение на продукцию цитокинов Thl типа представляет новый терапевтический подход к усилению иммунного надзора.

Обнаружены ЭПС, оказывающие защитный эффект на клетки по отношению к вирусу гриппа [16]. Авторы получили ЭПС из Bacillus marinus. Основная цепь полисахарида была построена из остатков (1^4)-связанной глюкозы и глюкуроно-вой кислоты. Он обладает способностью к удалению свободных радикалов и противоопухолевой активностью. Молекулярная масса основной фракции ЭПС составляла 500 kDa, фракция содержала сульфатные группы (20,2%) и состояла из остатков глюкозы и глюкуроновой кислоты в молярном соотношении 3:1, соответственно.

На эпителиоподобной клеточной линии почки собаки было исследовано противовирусное действие как нативного ЭПС, так и основной фракции по отношению к вирусу гриппа H1N1. В результате исследования цитотоксичности образцов было установлено, что нативный ЭПС можно использовать в качестве антивирусного средства без очистки. Ингибирующий эффект образцов по отношению к вирусу гриппа H1N1 в концентрациях 10, 20 и 40 мкг/мл исследовали методом ин-гибирования бляшкообразующей активности. Ингибирующий эффект нативного ЭПС при указанных концентрациях составил 7, 16,6 и 32%, соответственно. Ингибирующий эффект основной фракции составил 6, 15 и 31,4%. Этот результат (несколько более высокий эффект нативного ЭПС) согласуется с данными других авторов, показавших высокую противовирусную активность и низкую токсичность для клеток сульфатирован-ных полисахаридов из других источников.

Противовирусная активность соединений зависит как от степени сульфатирования, так и от молекулярной массы. При этом полисахариды, содержащие большое количество остатков уроно-вой кислоты, проявляют низкую противовирусную активность. Для противовирусной активности важно также определённое положение сульфатных групп [49]. Известно, что сульфатирован-ные экзополисахариды препятствуют проникно-

вению вирусов в клетку-хозяина и ингибируют ретровирусные обратные транскриптазы [47, 50].

Антибактериальное и ингибирующее действие на формирование биоплёнок. Известно антимикробное действие полисахаридов, полученных из гид-робионтов (водорослей, беспозвоночных) [51]. В последние годы положительную оценку антибактериального действия получают экзополисахари-ды морских бактерий. Так, A. K. El Essawy et al. [51, 52] исследовали антимикробное действие ЭПС, полученного из морского микроорганизма Klebsiella sp., изолированного из морских донных отложений. Моносахаридный состав этого ЭПС был представлен галактозой (16%), фруктозой (20%), глюкозой (32%), фукозой (22%) и уроновой кислотой (10%). При исследовании антибактериальной и антифунгальной активности нативного и модифицированного (сульфатированного) ЭПС по отношению к тест-бактериям (Escherichia coli и Staphylococcus aureus) и грибу (Candida albicans) установлено, что оба ЭПС подавляли рост E.coli и S.aureus, но не ингибировали рост C.albicans. Наибольший размер зоны ингибирования роста E.coli (22 мм) и S.aureus (30 мм) давал нативный ЭПС. Сульфатированный ЭПС обусловливал образование зоны ингибирования E.coli — 20 мм и S.aureus — 22 мм. Минимальная ингибирующая концентрация нативного и сульфатированного полисахаридов, обеспечивающая наибольшую зону инги-бирования роста обоих микроорганизмов, составляла 15 мг/дл. Авторы высоко оценивают ЭПС из Klebsiella sp. как сильное антибактериальное средство против грамположительных и грамотрица-тельных микроорганизмов.

В настоящее время считается, что более 65% всех инфекционных заболеваний обусловлены микроорганизмами, существующими в виде биоплёнок [54, 55]. Это — инфекции сердечных клапанов, раневых поверхностей, кишечные инфекции, гингивиты, стоматиты, образование зубного камня, бактериальные и грибковые отиты, и пр. В связи с высокой агрессивностью патогенных микроорганизмов по сравнению с комменсалами происходит преимущественное заселение ими любых инородных тел, вводимых в организм человека. Биоплёнки образуются на постоянных катетерах, контактных линзах, эндопротезах, эндоскопах и пр. [54]. Результаты исследований, опубликованные в последние годы, свидетельствуют о том, что учёные только приблизились к пониманию фундаментальных принципов феномена плёнкообразования. Микробиология в этом вопросе находится пока на этапе эмпирического накопления знаний. Известно, что микроорганизмы в составе биоплёнки по сравнению с планктонными формами отрицательно влияют на течение хронических воспалительных заболеваний, поскольку они обладают высоким уров-

нем толерантности к антителам, антибиотикам, ксенобиотикам, антисептикам, дезинфектантам и фагоцитам [56]. Всё это диктует необходимость поиска и разработки новых эффективных средств и способов воздействия на биоплёнки.

Известно, что доля ЭПС в биоплёнке может составлять примерно 50—90% от общего количества органического вещества [57]. Состав и количество ЭПС зависит от типа микроорганизма, возраста биоплёнок и условий окружающей среды, в которых существует биоплёнка (уровень кислорода и азота, влажность окружающей среды, свойства поверхности и адгезионные свойства бактерий) [58].

P. Jiang et al. [58] показали, что ЭПС А101, полученный из супернатанта морской бактерии Vibrio sp. QY101, продуцирующей альгинат-лиа-зу, выделенной из распадающегося таллома бурой водоросли Laminaria, не только препятствует образованию биоплёнки многих грамположи-тельных и грамотрицательных микроорганизмов, но и разрушает биоплёнки некоторых бактерий. Авторы позиционировали это соединение как первый ЭПС двойного действия. Было показано, что ЭПС А101 ингибировал образование биоплёнки Pseudomonas aeruginosa. Авторы предположили, что причиной этого является альги-нат-лиаза, однако вскоре было показано, что очищенный фермент из этого ЭПС такими свойствами не обладал. Дальнейшие исследования позволили авторам предположить, что компонент, ингибирующий образование биоплёнки, является полисахаридом. Практически важным является то, что ЭПС А101 усиливал способность антибиотиков разрушать биоплёнку. Было показано, что использование только амикацина не разрушало плёнку P.aeruginosa. Однако в присутствии ЭПС А101 (100 мкг/мл) происходило её полное уничтожение. Экзополисахарид А101 также ингибировал адгезию бактерий к поверхности клеток и межклеточную адгезию, что является очень важным обстоятельством при формировании биоплёнки.

В составе биоплёнки часто бывает несколько разных микроорганизмов, при этом наблюдаются скопления бактерий разной величины. Оказалось, что в присутствии ЭПС А101 агрегаты P.aeruginosa и S.aureus резко уменьшаются в размерах. Авторы позиционируют ЭПС А101 как возможный мощный терапевтический инструмент в лечении инфекций, вызванных этими микроорганизмами.

Рефераты: Дипломная работа: Банковская система России. Анализ становления и тенденции развития -

Таким образом, воздействие ЭПС, полученного из Vibrio sp., может быть направлено на блокирование механизмов адгезии бактерий к поверхности, разрушение полимерного матрикса, нарушение связей между микроорганизмами и клетками. Эффективным оно может быть и в слу-

чае сочетания его с бактерицидными агентами, в частности, с антибиотиками.

Близкие результаты были получены F. Brian-Jaisson et al. [59] при исследовании анти-биоплёночного действия трёх ЭПС (Sol-EPS, LB-EPS, TB-EPS), выделенных из планктонных микроорганизмов и биоплёнки Pseudoalteromonas ulvae TC14, грамотрицательной пигментированной бактерии, выделенной с поверхности бурой водоросли Ulva latuca. Из ЭПС были выделены две полисахаридные фракции — кислая и нейтральная. Кислая фракция была получена из TB-EPS, прочно связанного с бактериальной клеткой (капсульное вещество), и ингибировала с дозоза-висимым эффектом образование биоплёнки. Основными составляющими этой фракции были два глюканоподобных полисахарида. Роль EPS фракций в природе возможно связана с функцией антиобрастания.

Супернатанты каждого вида бактерий содержат разные антиплёночные молекулы, функционирующие выборочно в зависимости от вида микроорганизма. Доказательством этого является работа R. Papa et al. [60], в которой авторы исследовали антибиоплёночный эффект супернатан-тов бактерий, адаптированных к холоду. Одной из стратегий выживания полярных бактерий в экстремальных условиях авторы считают производство метаболитов с антиплёночным действием, что используется микроорганизмами как оружие конкуренции с другими микроорганизмами за источники питания в экстремальной ситуации.

Действие полисахаридов обусловлено конкурентным ингибированием мультивалентных углеводно-белковых взаимодействий [61]. Антиплёночные полисахариды могут блокировать лектины или сахарсвязывающие белки, находящиеся на поверхности бактерий, или блокировать концевые адгезины фимбрий и пилей. Некоторые исследования показывают, что полисахариды могут действовать как сигнальные молекулы, которые модулируют экспрессию генов бактерий-реципиентов [62]. Антиплёночные ЭПС могут также изменять физические свойства абиотических поверхностей [63]. Предварительная обработка таких поверхностей ЭПС снижает способность E.coli, Staphylococcus aureus, S.epidermidis, Enterococcus faecalis образовывать плёнки. Также антиплёночные ЭПС могут обладать способностью воздействовать на физические свойства поверхности бактериальных клеток. Например, ЭПС из Bacillus licheniformis снижал ги-дрофобность клеточной поверхности E.coli [64]. Это приводило к снижению уровня адгезии бактериальных клеток и уменьшению аутоагрегации.

Мы привели только краткие сведения об ан-тибиоплёночных эффектах ЭПС морских бактерий в связи с тем, что этот вопрос получил освещение в нашей более ранней работе [50].

Влияние ЭПС на липидный и углеводный обмен.

Ведущее место среди причин развития сердечнососудистых заболеваний занимает атеросклероз, сопровождающийся, как правило, дислипидеми-ей. Около 30% пациентов с дислипидемией нечувствительны к статинам, которые наиболее часто применяются при этой болезни. Кроме того, в отдельных случаях статины оказывают нежелательное действие на организм, а ряду пациентов они противопоказаны. Ряд побочных эффектов вызывают и антидиабетические препараты. В связи с этим остаётся актуальным поиск новых безвредных и эффективных средств гиполипидемической и антидиабетической терапии [65].

Известно, что полисахариды из гидробионтов могут регулировать липидный и углеводный обмен [66]. В последнее время появились работы, в которых представлены результаты экспериментальных исследований антидислипидемического и антидиабетического действия ЭПС из морских бактерий. Несмотря на то, что таких работ пока еще немого, они свидетельствуют о большом терапевтическом потенциале этих соединений [67, 68]. Большой интерес в этом плане представляет работа M. A. M. Ghoneim et al. [68], которые исследовали действие ЭПС из микроорганизма Bacillus subtilis при сердечно-сосудистых нарушениях у крыс с экспериментальным диабетом. Известно, что значительную роль в патогенезе сахарного диабета играют метаболические нарушения и окислительный стресс. Поскольку ЭПС из морских бактерий обладают сильным антиокси-дантным действием, их применение при диабете может быть эффективным. Бактериальный штамм был выделен из морского грунта под мантрами. Штамм NRC-108, продуцирующий значительное количество ЭПС, был идентифицирован на основе морфологических, физиологических и биохимических характеристик с определением последовательности 16s рРНК. Показатель токсичности ЭПС составил 600 мг/кг. В состав полисахарида входили маннуроновая и глюкуроновая кислоты, глюкоза, галактоза и манноза в молярном соотношении 1,6:1,5:1,0:2,3:1,4, соответственно. Молекулярная масса соединения составила 1,66х104 г/моль. При определении липидного спектра сыворотки крови у подопытных крыс было установлено, что у животных с экспериментальным диабетом, индуцированным стрептозо-тоцином, отмечается увеличение уровня общего холестерина (ОХ), триглицеридов (ТГ), липопро-теидов низкой плотности (ЛПНП), липопротеи-дов очень низкой плотности (ЛПОНП) и снижение липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) по сравнению с интактными животными. У крыс, леченных ЭПС, отмечено снижение уровня ОХ, ЛПНП, ЛПНП и ОЛПНП и повышение ЛПВП. У крыс с диабетом также был повышен уровень мо-

лекул адгезии VCAM и ICAM по сравнению с контролем. Введение ЭПС таким животным снижало уровень этих молекул.

Как известно, гидроксильные радикалы являются наиболее реакционно способными и инициируют значительное повреждение клеток in vitro и in vivo [69]. Гидроксильные радикалы и ROS могут быть решающими эффекторами в повреждении в-клеток поджелудочной железы. M.A.M. Ghoneim et al. [68] на крысах с диабетом показали значительное уменьшение показателя концентрации радикалов DPPH в крови у животных, получавших ЭПС. В. В. Вельков исследовал динамику уровня тропонина — маркера миокар-диального некроза [70]. Диабет вызывает прогрессирующее повреждение миокарда, что увеличивает степень риска у пациентов с хронической сердечной недостаточностью. У крыс с диабетом, получавших ЭПС, уровень тропонина был значительно снижен по сравнению с животными с моделью диабета, не получавшими ЭПС (34,65±2,59 и 47,27±2,18 пг/мл, соответственно). Кроме того ЭПС из B.subtilis снижает уровень глюкозы в крови у диабетических животных (с 206,55 6,24 до 82,7±3,08 пг/мл, соответственно) и повышает содержание инсулина в их крови, что может быть обусловлено подавлением глюконеогенеза в печени и сопровождается подавлением липолиза в жировой ткани [71]. И, наконец, у крыс с экспериментальным диабетом ЭПС значительно уменьшал дегенеративные изменения в миокарде и тканях аорты.

Приведённые материалы позволяют считать, что ЭПС морских бактерий обладают большим потенциалом в качестве средств, нормализующих липидный и углеводный обмен.

ЭПС морских микроорганизмов в восстановлении костной и хрящевой ткани. Морские микроорганизмы представляют собой неисчерпаемый источник ЭПС, которые можно использовать для лечения заболеваний, связанных с разрушением хрящевой или костной ткани, раневыми процессами [12, 72, 73]. Так, из морского микроорганизма Vibrio diabolicus, выделенного из полихет Alvenella pompejana, получен ЭПС HE 800. Полисахарид содержал равное количество гиалуроно-вой кислоты и гексозаминов (N-ацетилглюкоза-мин и N-ацетилгалактозамин). Коммерческое название этого биополимера — Гиалурифт® [8]. Эффективность этого высокомолекулярного соединения оценивали в экспериментах с восстановлением целостности кости у крыс Vistar. В качестве контроля был использован коллаген. Испытуемые вещества помещали в отверстие, сделанное в левой теменной кости животных. В отверстие в правой теменной кости не закладывали никаких препаратов. У 95% крыс с ЭПС регистрировалось полное заживление костного дефекта

через 15 дней после начала эксперимента. Анатомия дефекта (трабекулярная и корковая структура) была полностью восстановлена. У животных, обработанных коллагеном, и не получивших какого бы то ни было лечения, значительных признаков выздоровления к этому сроку не было примерно у 30% животных. Авторы объясняют эти результаты доказанными ими in vitro эффектами — улучшением структурирования коллагена в соединительной ткани и образованием фиброб-ластов во внеклеточном матриксе. Данные результаты свидетельствуют о возможности создания коллагеновой ткани для кожной или хрящевой трансплантации [72], а бактериальные ЭПС представляют собой значительный потенциал в клеточной терапии и тканевом инжиниринге.

Заключение

Морская биотехнология является новой дисциплиной, направленной на промышленное использование природных ресурсов океана. Особенно это важно для медицины, т. к. морские биоресурсы представляют собой богатый источник биологически активных веществ, который может быть использован для разработки новых классов лекарственных препаратов, БАД к пище, продуктов функционального питания, косметических средств, материалов для лечения ран и пр. Биологические вещества, полученные из морских источников, как правило, более разнообразны и активны, чем их аналоги из наземных источников, поскольку гидробионты обитают в крайне разнообразной внешней среде и, в связи с этим, вырабатывают высокоактивные защитные соединения. Большое значение в этом процессе имеет также более длительная эволюция многих групп морских обитателей, позволившая развить в них чрезвычайно широкий спектр биохимических адаптаций.

Все это побудило авторов настоящей работы обратить внимание российских биологов, врачей и биотехнологов на морские микроорганизмы, в частности, на бактерии, которым, на наш взгляд, в

ЛИТЕРАТУРА

1. Blunt J.W., Copp B.R., Keyzers R.A., Munro M.H., Prinsep M.R. Marine natural products. Nat Prod Rep 2021; 33 (3): 382—431. doi: 10.1039/c5np00156k.

2. Михайлов ВВ. Морская микробиология в ТИБОХ ДВО РАН. Вестник ДВО РАН. — 2005. — 4. — С. 145—151. / Mikhajlov V.V. Morskaya mikrobiologiya v TIBOKH DVO RAN. Vestnik DVO RAN 2005; 4: 145—151. [in Russian]

3. Михайлов В В., Пивкин М.В. Изучение морских бактерий и грибов. Вестник ДВО РАН. — 2021. — № 1. — С. 149—156. / Mikhajlov V.V., Pivkin M.V. Izuchenie morskikh bakterij i gribov. Vestnik DVO RAN 2021; 1: 149—156. [in Russian]

4. Freitas F., Alves V., Reis M.Advances in bacterial exopolysaccharides: from production to biotechnological applications. Trends Biotechol 2021; 29 (8): 388—398.

5. Manivasagan P., Kim S.K. Extracellular polysaccharides produced by marine bacteria. Adv Food Nutr Res 2021; 72: 79—94. doi: 10.1016/B978-0-12-800269-8.00005-1

последнее десятилетие в нашей стране уделяется недостаточное внимание. Потенциал морских бактерий и их экзополисахаридов остаётся в значительной степени неисследованным, хотя морские бактерии в настоящее время считаются эффективными производителями биологически активных и/или химически новыгх соединений. В связи с возможностью культивирования их в биореакторах различной емкости не возникает проблем с их производством. Биомасса этих гидроби-онтов в морях довольно значительна, и за рубежом исследования потенциальных возможностей ЭПС морских бактерий весьма быстро развиваются.

В обзоре в сжатой форме представлены основные направления биомедицинских исследований экзополисахаридов, полученных из морских бактерий. Океаны и моря являются источником но-выгх микроорганизмов с новыми, часто неожиданными механизмами действия. Медленное продвижение на фармацевтический рынок лекарственных препаратов на их основе связано со многими трудностями, среди которых имеет место недостаточно развитое междисциплинарное сотрудничество фармакологов, биотехнологов, молекулярных биологов, химиков, генетиков, экологов и врачей различных специальностей.

Требуют дальнейшего развития исследования, связанные с использованием ЭПС в качестве безвредных и эффективных адьювантов вакцин, антимикробных средств, компонентов БАД к пище, продуктов функционального питания, пребиотиков.

По-видимому, в дальнейшем усилия учёных должны быть направлены на получение низкомолекулярных фрагментов ЭПС, оценку их способности связышаться с различными рецепторами клеток организма для достижения того или другого терапевтического эффекта. После этого перспективные соединения могут быть синтезированы. Имеются все основания надеяться, что препараты из морских бактерий займут достойное место в широком ассортименте лекарственных и парафармацевтических средств.

6. Field С.В., BehrenfeldM.J., Randerson J.T., Falkowski P. Terrestrialand oceanic components primary production of the biosphere. Integrating 1998; 281: 237—240. doi:10.1126/science.281.5374.237

7. Casillo A., Lanzetta R, Parrilli M, CorsaroM.M. Exopolysaccharides from marine and marine extremophilic bacteria: structures, properties, ecological roles and applications. Mar Drugs 2021; 16 (2): 69—78. doi:10.3390/md16020069

8. Senni K, Pereira J., Gueniche F. et al. Marine polysaccharides: a source of bioactive molecules for cell therapy and tissue engineering. Mar Drugs 2021; 9: 1664—1681. doi:10.3390/md9091664

9. Heissenberger A., Leppard G.G., Hernd G.J. Relationship between the intracellular integrity and the morphology of the capsular envelope in attached and free-living marine bacteria. Appl Environ Microbiol. 1996; 62: 4521—4528.

10. Harutoshi T. Exopolysaccharides of Lactic Acid Bacteria for Food and Colon Health Applications 2021; 1: 515—538. doi:10.5772/50839

11. Caliceti P., Salmaso S., Bersani S. Polysaccharide-based anticancer pro-drugs. In Macromolecular anticancer therapeutics ed. Reddy, L., H. and Couvreur, P. New York, NY: Humana Press Inc 2021; 163—219.

12. Moscovici M. Present and future medical applications of microbial exopolysaccharides. Front Microbiol 2021; 6: 1012—1022. doi: 10.3389/fmicb.2021.01012.

13. Poli A., Anzelmo G, Nicolaus B. Bacterial exopolysaccharides from extreme marine habitats: production, characterization and biological activities. Mar Drugs 2021; 8 (6): 1779—802. doi: 10.3390/md8061779.

14. Delbarre-Ladrat C.,Sinquin C, Lebellenger L. et al. Exopolysaccharides produced by marine bacteria and their applications as glycosaminoglycan-like molecules. Front Chem 2021; 2: 85. doi: 10.3389/fchem. 2021.00085

15. Finore I., Di Donato P., Mastascusa V. et al. Fermentation technologies for the optimization of marine microbial exopolysaccharide production. Mar Drugs 2021; 12 (5): 3005—3024. doi: 10.3390/md12053005

16. Osama H, El Sayed, Abd El Kader et al. Isolation, characterization and biological activities of exopolysaccharide produced by Bacillus marinus. Der Pharma Chemica 2021; 7 (2): 200—208.

17. Wu S, Liu G, Jin W. et al. Antibiofilm and anti-infection of a marine bacterial exopolysaccharide against Pseudomonas aeruginosa. Front Microbiol. 2021; 7: 102. doi: 10.3389/fmicb.2021.00102

18. Медведев C.C. Физиология растений. СПб. БХВ-Петербург, 2021. — 512 с. / Medvedev S.S. Fiziologiya rastenij. SPb. BKHV-Peterburg 2021; 512. [in Russian]

19. Mohsen M. S, Asker, Manal G. et al. Inhibitory effect of exopolysaccha-ride from Achromobacter piechaudii NRC2 against cyclooxygenases and acetylcholinesterase with evaluation of its antioxidant properties and structure elucidation. Der Pharmacia Lettre 2021; 7 (4): 129—141.

20. Hardas S.S., Sultana R, Clark A.M. et al. Oxidative modification of lipoic acid by HNE in Alzheimer disease brain. Redox Biol 2021; 1: 1: 80—85. doi: 10.1016/j.redox.2021.01.002

21. Duh P.D., Tu Y.Y., Yen G.C. Antioxidantactivity ofWater extract of harngjyur (Chrysanthemum morifolium Ramat). LebensmittelWissenschaft and Technologie 1999; 32: 269—277.

22. Tsiapali E, Whaley S, Kalbfleisch J. et al. Glucans exhibit weak antiox-idant activity, but stimulate macrophage free radical activity. Free Radic Biol Med 2001; 30 (4): 393—402.

23. Priyanka P., Arun A.B., Ashwini P. et al. Versatile properties of an exopolysaccharide R-PS18 produced by Rhizobium sp. PRIM-18. Carbohydr Polym 2021; 126: 215—221. doi: 10.1016/j.carbpol.2021. 03.017

24. Pawar R., Mohandass C., Sivaperumal E. et al. Epiphytic marine pigmented bacteria: A prospective source of natural antioxidants. Braz J Microbiol 2021; 46 (1): 29—39.doi: 10.1590/S1517-838246120210353

25. Lin M.H., Yang Y.L., Chen Y.P. et al. A novel exopolysaccharide from the biofilm of Thermusaquaticus YT-1 induces the immune response through Toll-like receptor 2. Biol Chem. 2021; 286 (20): 17736—17745. doi: 10.1074/jbc.M110.200113

26. Yu L., Sun G., Wei J. Activation of macrophages by an exopolysaccharide isolated from Antarctic Psychrobacter sp. B-3. Chinese J. of Oceanology and Limnology 2021; 34: 5: 1064—1071.

27. Bai Y., Zhang P., Chen G. et al. Macrophage immunomodulatory activity of extracellular polysaccharide (PEP) of Antarctic bacterium Pseudoaltermonas sp. S-5. International Immunopharmacology 2021; 12: 4: 611—617.

28. Courtois A., Berthou C., Guezennec J., Boisset C. et al. Exopolysaccharides isolated from hydrothermal vent bacteria can modulate the complement system. PLoS One 2021; 9 (4): e94965. doi: 10.1371/journal.pone. 0094965

29. Zanchetta P., Lagarde N., Guezennec J. A new bone-healing material: a hyaluronic acid-like bacterial exopolysaccharide. Calcif Tissue Int. 2003; 72 (1): 74—79.

30. Смолина Т.П., Беседнова H.H. Влияние гликополимеров морских бактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens на экспрессию молекул адгезии лейкоцитами человека. Здоровье. Медицинская экология. Наука. — 2021. — Т. 3. — № 57. — 49—50. / Smolina T.P., Besednova N.N. Vliyanie glikopolimerov morskikh bakterij Pseudoalteromonas nigri-faciens na ekspressiyu molekul adgezii lejkotsitami cheloveka. Zdorov’e. Meditsinskaya ekologiya.Nauka 2021; 3: 57: 49—50. [in Russian]

31. Смолина Т.П., Запорожец Т.С., Беседнова H.H. Активация клеток врожденного иммунитета человека липополисаридом и экстрацеллюлярным полисахаридом морских бактерий. Антибиотики и химиотер. — 2021. — № 7—8: C. 3—7. / Smolina T.P., Zaporozhets T.S., Besednova N.N. Aktivatsiya kletok vrozhdennogo immu-niteta cheloveka lipopolisaridom i ekstratsellyulyarnym polisakharidom morskikh bakterij. Antibiotiki i khimioterap 2021; 7—8: 3—7. [in Russian]

32. ВОЗ. Информационный бюллетень 2021; 2: 95: 85—164. / VOZ. Informatsionnyj byulleten’ 2021; 2: 95: 85—164

33. Goldstraw P., Ball D., Jett J R. et al. Non-smallcell lung cancer. Lancet 2021; 378: 1727—1740.

34. Cao R., Jin W., Shan Y. et al. Marine bacterial polysaccharide EPS11 inhibits cancer cell growth via blocking cell adhesion and stimulating anoikis. Mar Drugs 2021; 16 (3): 85—96. doi: 10.3390/md16030085.

35. Gilmore A.P. Anoikis. Cell Death Differ 2005; 12: 1473—1477. doi:10.1038/sj.cdd.4401723

36. Sanders T.A., Llagostera E., Barna M.Specialized filopodia direct longrange transport of SHH during vertebrate tissue patterning. Nature 2021; 497 (7451): 628—632. doi: 10.1038/nature12157

37. Jacquemet G., Hamidi H., Ivaska J. Filopodia in cell adhesion, 3D migration and cancer cell invasion. Curr Opin Cell Biol. 2021; 36: 23—31. doi: 10.1016/j.ceb.2021.06.007

38. Jacquemet G., Hamidi H., Ivaska J. Filopodia in cell adhesion, 3D migration and cancer cell invasion. Current Opinion in Cell Biology 2021; 36: 23—31.

39. El-Newary S.A., Ibrahim A.Y., Asker M.S. et al. Production, characterization and biological activitieso facidicexopolysaccharidefrommarine Bacillus amylolique faciens 3MS 2021. AsianPac J TropMed 2021; 10 (7): 652—662. doi: 10.1016/j.apjtm.2021.07.005

40. Heymann D., Ruiz-Velasco C., Chesneau J. et al. Anti-Metastatic Properties of a Marine Bacterial Exopolysaccharide-Based Derivative Designed to Mimic Glycosaminoglycans. Molecules 2021; 21 (3): 309. doi: 10.3390/molecules21030309

41. Roger O., Kervarec N., Ratiskol J. et al. Structural studies of the main exopolysaccharide produced by the deep-sea bacterium Alteromonas infernus. Carbohydr Res 2004; 339 (14): 2371-2380.

42. Chopin N., Sinquin C., Ratiskol J. et al. A Direct Sulfation Process of a Marine Polysaccharide in Ionic Liquid. Biomed Res Int 2021; 2021: 508—656. doi: 10.1155/2021/508656

43. Ruiz-Ruiz C., Srivastava G.K., Carranza D. et al. An exopolysaccharide produced by the novel halophilic bacterium Halomonasstenophila strain B100 selectively induces apoptosis in human T leukaemia cells. Appl Microbiol Biotechnol 2021; 89 (2): 345—355. doi: 10.1007/s00253-010-2886-7

44. Abdelnasser S.M, Yahya S.M, Mohamed W.F. et al. Antitumor exopolysaccharides derived from novel marine bacillus: isolation, characterization aspect and biological activity. Asian Pac J CancerPrev 2021; 18 (7): 1847—1854. doi:10.22034/apjcp.2021.18.7.1847

45. Arena A.,Maugeri T.L., Pavone B. et al. Antiviral and immunoregulatory effect of a novel exopoly saccharide from a marine thermotolerant Bacillus licheniformis. Int Immunopharmacol 2006; 6 (1): 8—13. doi:10.1016/j.intimp.2005.07.004

46. Gugliandolo C., Spano A., Maugeri T.L. et al. Role of bacterial exopolysaccharides as agents in counteracting immune disorders induced by herpes virus. Microorganisms 2021; 3 (3): 464—483. doi: 10.3390/microorganisms3030464

47. Matsuda M., Shigeta S., Okutani K. Antiviral Activities of Marine Pseudomonas Polysaccharides and Their Oversulfated Derivatives.Mar Biotechnol (NY) 1999; 1: 68—73.

48. Nicolaus B., Panico A., Manca M.C. et al. A thermophilic Bacillus isolated from an Eolian shallow hydrothermal vent, able to produce exopolysaccharides. Syst Appl Microbiol. 2000; 23(3): 426—32.

49. Hayashi K., Nakano T., Hashimoto M. et al. Defensive effects of a fucoidan from brown alga Undariapinnatifida against herpes simplex virus infection.Int Immunopharmacol 2008; 8 (1): 109—116.

50. Беседнова H.H., Макаренкова И.Д., Звягинцева Т.Н. и др. Ингибирующее действие полисахаридов морских гидробионтов на формирование биопленок. Антибиотики и химиотерапия. — 2021. — 61. — № 9—10. — С. 64 [in Russian] — 71. / Besednova N.N., Makarenkova I.D., Zvyagintseva T.N. i dr. Ingibiruyushchee dejstvie polisakharidov morskikh gidrobiontov na formirovanie bioplenok. Antibiotiki i khimioterapiya 2021; 61: (9—10): 64—71. [in Russian]

51. El Essawy A. K., Abu Shady H.M., Abu El Kher A.M., Helal M.M. Molecular characterization of a marine klebsiella isolate by 16s riboso-mal rna gene sequence and optimization of its exopolysaccharide production. Egypt J Exp Biol (Bot.) 2021; 11 (2): 227—236.

52. El Essawy A.K., Abu Shady H.M., Abu El Kher A.M., Helal M.M. Antimicrobial, anticoagulation, fibrinolytic and prebiotic activities of exopolysaccharide produced by marine Klebsiella spp. Egypt. J. Exp. Biol. (Bot.) 2021; 12 (2): 267—274. doi: 10.4172/1948-5948-C1-034

53. Голуб А. В. Бактериальные биопленки — новая цель терапии? Клин микробиол антимикроб химиотерапия 2021; 14: 1: 23—29. / Golub A.V. Bakterial’nye bioplenki — novaya tsel’ terapii? Klin mikrobiol antimikrob khimioterapiya 2021; 14: 1: 23—29. [in Russian]

54. Spano A., Lagana P., Visalli G. et al. In vitro antibiofilm activity of an exopolysaccharide from the marine thermophilic Bacillus licheniformis T14. Curr Microbiol 2021; 72 (5): 518-28. doi: 10.1007/s00284-015-0981-9.

55. Маянский A.H., Чеботарь ИВ. Стратегия управления бактериальным биопленочным процессом. Журнал инфектологии. — 2021. — Т. 4 — № 3. — С. 5—15. / MayanskijA.N., Chebotar’I.V. Strategiya upravleniya bakterial’nym bioplenochnym protsessom. Zhurnal infektologii 2021; 4: 3: 5—15. [in Russian]

56. Donlan R. M. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases 2002; 8: 9: 881-890.

57. Vu B, Chen M, CrawfordR.J., Ivanova E.P. Bacterial extracellular polysaccharides involved in biofilm formation. Molecules 2009; 14 (7): 2535-2554. doi: 10.3390/molecules14072535.

58. Jiang P., Li J., Han F. et al. Antibiofilm activity of an exopolysaccharide from marine bacterium Vibrio sp. QY101. PLoS One 2021; 6 (4):18514. doi: 10.1371/journal.pone.0018514

59. Brian-Jaisson F., Molmeret M, Fahs A. et al. Characterization and anti-biofilm activity of extracellular polymeric substances produced by the marine biofilm-forming bacterium Pseudoalteromonas ulvae strain TC14. Biofouling 2021; 32 (5): 547-60. doi: 10.1080/08927014.2021.1164845.

60. Papa R, Selan L, Parrilli E. et al. Anti-Biofilm activities from marine cold adapted bacteriaagainst Staphylococci and Pseudomonas aeruginosa. Front Microbiol 2021; 6: 1333. doi: 10.3389/fmicb.2021.01333

61. Wittschier N, Lengsfeld C, Vorthems S. et al. Large molecules as anti-adhesive compounds against pathogens. Pharm Pharmacol 2007; 59 (6): 777-786. doi: 10.1211/jpp.59.6.0004

62. Kim H.S., Kim S.M., Lee H.J. et al. Expression of the cpdA gene, encoding a 3′,5′-cyclic AMP (cAMP) phosphodiesterase, is positively regulated by the cAMP-cAMP receptor protein complex. Bacteriol 2009; 191 (3): 922-930. doi: 10.1128/JB.01350-08

63. Valle J., Da Re S, Henry N. et al. Broad-spectrum biofilm inhibition by a secreted bacterial polysaccharide. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103 (33): 12558-12563.

64. Sayem S.M., Manzo E, Ciavatta L. et al. Anti-biofilm activity of an exopolysaccharide from a sponge-associated strain of Bacillus licheniformis. Microbial Cell Factories 2021; 10: 74. doi: 10.1186/1475-2859-10-74

65. Erejuwa O. Effect of honey in diabetes mellitus: matters arising. J Diabetes Metab Disord 2021: 13 (1): 23. doi: 10.1186/2251-6581-13-23

66. Крыжановский С. П., Гелъцер Б.И., Запорожец Т.С. и др. Бурые водоросли Тихого океана в лечении и профилактике атеросклероза.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

Беседнова Наталия Николаевна – академик РАН, профессор, главный научный сотрудник лаборатории иммунологии ФГБНУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова», Владивосток

Смолина Татъяна Павловна – к. б. н., ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии ФГБНУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова», Владивосток Андрюков Борис Георгиевич – д. м. н., зав. лабораторией молекулярной эпидемиологии и микробиологии ФГБНУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова», Владивосток

Владивосток. Дальнаука. – 2021. – 152 с. / Kryzhanovskij S. P., Gel’tser B.I., Zaporozhets T.S. i dr. Burye vodorosli Tikhogo okeana v lechenii i pro-filaktike ateroskleroza. Vladivostok. Dal’nauka 2021; 152 s. [in Russian]

67. Zhou X., Wang F., Yang H. et al. Selenium enriched exopolysaccharides produced by Enterobacter cloacae Z0206 alleviate adipose inflammation in diabetic KKAy mice through the AMPK/SirT1 pathway. Mol Med Rep 2021; 9 (2): 683-688. doi: 10.3892/mmr.2021.1859

68. Ghoneim M.A.M., Hassan A.I., Mahmoud M.G. et al. Effect of polysaccharide from Bacillus subtilis sp. on cardiovascular diseases and athero-genic indices in diabetic rats. BMC Complement Altern Med 2021; 16: 112. doi: 10.1186/s12906-016-1093-1.

69. Rollet-Labelle E, Grange M.J., Elbim C. et al. Hydroxyl radical as a potential intracellular mediator of polymorphonuclear neutrophil apop-tosis.Free Radic Biol Med 1998; 24 (4): 563-572.

70. Велъков B.B. Новые международные критерии инфаркта миокарда и высокочувствительные тропонины: новые возможности и новые проблемы. Клиническая лабор диагностика. – 2021. – № 2. – С. 64: 59-71. / Velkov V.V. Novye mezhdunarodnye kriterii infarkta miokarda i vysokochuvstvitel’nye troponiny: novye vozmozhnosti i novye problemy. Klinicheskaya labor diagnostika 2021; 2: 64: 59-71. [in Russian]

71. Postic C.,Dentin R, Girard J. Role of the liver in the control of carbohydrate and lipid homeostasis.Diabetes Metab 2004; 30 (5): 398-408.

72. Senni K, Singuin C, Collec-Jouaults et al. Sulfated depolymerized derivatives of exopolysaccharides (EPS) from mesophilic marine bacteria, method for preparing same, and uses thereof in tissue regeneration. 0.131,472. US Patent 2008; jun 5.

73. Rederstorff E,, Rethore G, Weiss P. et al. Enriching a cellulose hydrogel with a biologically active marine exopolysaccharide for cell-based cartilage engineering. J Tissue Eng Regen Med 2021; 11 (4): 1152-1164. doi: 10.1002/term.2021

Кузнецова Татьяна Алексеевна — д. м. н., зав. лаб. иммунологии ФГБНУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова», Владивосток

Михайлов Валерий Викторович — чл.-корр. РАН, профессор, руководитель Коллекции морских микроорганизмов ФГБУН «Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г. Б. Елякова» ДВО РАН, Владивосток Звягинцева Татьяна Николаевна — д. х. н., главный научный сотрудник лаб. химии ферментов ФГБУН «Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г. Б. Елякова» ДВО РАН, Владивосток