- Рднк-биотехнология. способы биотрансформации клеток
- Реферат: методы переноса генетического материала в клетки млекопитающих – – банк рефератов, сочинений, докладов, курсовых и дипломных работ
- Эффективность генетической трансформации соматических и эмбриональных клеток животных с использованием различных типов клеток-"упаковщиц"
Рднк-биотехнология. способы биотрансформации клеток
Генотерапия применима
не только к наследственным
заболеваниям. Предстоит решить
проблему лечения генами “чумы
XX века” — синдрома приобретенного
иммунодефицита (СПИД), возникающего при
заражении вирусом иммунодефицита человека
(ВИЧ). ВИЧ представляет собой ретровирус,
поражающий Т-лимфоциты и макрофаги. Болезнь
удалось бы победить, если бы были найдены
новые гены, введение которых в зараженные
ВИЧ лимфоциты останавливало бы дальнейшее
размножение вируса. Предложено множество
хитроумных способов борьбы со СПИДом
с помощью привнесенных генов. Все они
основаны на новейших данных о строении
и функционировании генома ретровируса.
Например, вводя прямо в мышцы больного
ретровирусные векторы, несущие отдельные
гены ВИЧ, ученые рассчитывали на то, что
гены ВИЧ после внедрения в ДНК хромосом
хозяина смогут дать информацию для синтеза
вирусных белков и произойдет “противоСПИДная”
иммунизация больного этими белками. Однако
еще не получено ощутимых результатов,
которые сулили бы успех в борьбе с вирусом
дикого типа, коварство которого заключается
в его изменчивости.
Огромные перспективы
открывает использование генотерапии
для лечения онкологических заболеваний.
Многолетние усилия ученых привели
к пониманию того, что рак —
это генетическое заболевание
и его развитие происходит
многостадийно, в результате серии
генетических нарушений, накапливающихся
в клетке. Следовательно, каждый
из таких отдельных генетических
эффектов может стать точкой
приложения генотерапевтического
подхода.
2.7 Получение трансгенных
животных
Если вводить ДНК
в клетки многоклеточного организма,
то результатом трансформации
будет изменение свойств лишь
небольшого числа клеток, которые
приобрели новый ген или гены.
Следовательно, для изменения
свойств всего организма следует
изменять геном половых клеток,
которые перенесут новые свойства потомкам.
У растений и животных целесообразно изменять
такие свойства, как скорость роста, устойчивость
к заболеваниям, способность адаптироваться
к новым внешним условиям. В качестве маркеров
в этом случае можно использовать полиморфизм
длины рестрикционных фрагментов (AFLP),
анализ мини-сателлитов, анализ микросателлитной
ДНК (SSR), гибридизацию и т.д.
Разработаны способы
введения генов в эмбриональные
клетки млекопитающих, мух и
некоторых растений. От работы
с довольно крупными яйцами
амфибий перешли к изучению
яйцеклеток и эмбрионов мыши,
которая представляет наиболее
изученное в генетическом отношении
млекопитающее.
Микроинъекцию клонированных
генов производят в один или
оба пронуклеуса только что
оплодотворенной яйцеклетки мыши.
Чаще выбирают мужской пронуклеус,
привнесенный сперматозоидом, так
как его размеры больше. После
инъекции яйцеклетку немедленно
имплантируют в яйцевод приемной
матери, или дают возможность
развиваться в культуре до
стадии бластоцисты, после чего
имплантируют в матку.
Можно вводить ген
в сперматозоиды и затем проводить ими
оплодотворение. Таким образом были инъецированы
гены интерферона и инсулина человека,
ген β-глобина кролика, ген тимидинкиназы
вируса простого герпеса и кДНК вируса
лейкемии мышей. Число молекул, вводимое
за одну инъекцию, колеблется от 100 до 300
000, а их размер – от 5 до 50 кб. Выживает обычно
10 – 30% яйцеклеток, а доля мышей, родившихся
из трансформированных яйцеклеток варьирует
от нескольких до 40%. Таким образом, реальная
эффективность составляет около 10%.
Интеграция чужеродных
генов неспецифична по отношению
к хромосомам, а число копий
чужеродного гена может различаться
от нескольких штук до 100 и более.
Эти гены образуют группу тандемных
повторов, объединенных по типу “голова
к хвосту”. Чужеродная ДНК после
инъекции была обнаружена как
в соматических, так и в половых
клетках. Это означает, что интеграция
проходит на самых ранних стадиях
развития зиготы.
В нескольких случаях
гетерологичная ДНК наследовалась
в трех поколениях мышей, что
свидетельствует о стабильной
интеграции. Интегрировавшая в половые
клетки ДНК передается как
менделевский ген. Установлено,
что уровень экспрессии чужеродного
гена зависит от места интеграции
ДНК с хромосомами и от степени
ее метилирования, а также от
дифференцировки тканей. В некоторых
случаях удалось получить тканеспецифическую
экспрессию. Важно отметить что
специфические чужеродные гены
можно встраивать в геном клетки
таким образом, что они подчиняются
нормальным регуляторным сигналам.
В 1981 году Константини
и Лэси (Оксфорд) провели инъекцию
в яйцеклетки мыши фрагменты
хромосомной ДНК кролика длиной
19 килобаз. Эти фрагменты содержали
ген β-глобина кролика. Яйцеклетки культивировали
до стадии бластоцисты и имплантировали
в матку. У 24 мышей, родившихся в результате
развития имплантированных яйцеклеток,
проведены частичная гепатоэктомия. Анализ
ДНК из клеток печени показал, что у 9 мышей
встречается от 1 до 20 копий на клетку гена
β-глобина. После спаривания 4 трансформированных
самцов с нормальными самками получили
потомство из 18 животных. 6 из них также
имели ген β-глобина. Установлено, что
интеграция гена в клетки млекопитающих
происходит случайным образом и не связана
с конкретными областями хромосомы. Ген
нестабилен, может быть утрачен или стать
неактивным. Вместе с геном необходимо
вводить регуляторные последовательности.
Метод введения генов
в эмбриональные клетки имеет
ограничения. Не всегда удается
встроить чужеродную ДНК в
заданный участок хромосомы. Разработанные
методические примы пока не
позволяют заменить имеющийся
в геноме ген, вытесняя его,
не всегда удается подчинить
новый ген системе регуляции
организма.
При трансгенозе могут
возникать неожиданные проблемы.
Например, одни из первых работ
по генетической транформации
животных проводились путем встраивания
генов гормона роста. Перенос
гена гормона роста крысы мышам
увеличивал рост мышей в 2 раза.
Эксперименты по трансгенозу
генов гормона роста быка кроликам
также увенчались успехом. А
вот аналогичные эксперименты
по модификации крупного рогатого
скота привели к увеличению
прироста всего на 10-20%. Очевидно,
это связанно с тем, что у
мышей сохраняется широкая норма
реакции, и встраивание генов,
увеличивающих количество гормона,
заставляет генотип реализоваться
максимально полно. У домашнего
скота в результате направленной
селекции организмы работают
на верхнем пределе нормы реакции,
отсюда ожидаемый эффект не
проявился.
В нашей стране получены
свиньи, несущие ген соматотропина.
Они не отличались по темпам
роста от нормальных животных,
но изменение обмена веществ
сказалось на содержании жира.
У таких животных ингибировались
процессы липогенеза и активировался
синтез белка. К изменению обмена
веществ приводило и встраивание
генов инсулиноподобного фактора.
Такие трансгенные свиньи были
созданы для изучения цепочки
биохимических превращений гормона,
а побочным эффектом явилось
укрепление иммунной системы.
Самая мощная белоксинтезирующая
система находится в клетках
молочной железы. Если поставить
гены чужих белков под контроль
казеинового промотора, то экспрессия
этих генов будет мощной и
стабильной, а белок будет накапливаться
в молоке (животное-ферментер). Уже
получены трансгенные коровы, в
молоке которых содержится человеческий
белок лактоферрин. Этот белок
планируют применять для профилактики
гастроэнтерологических заболеваний
у людей с низкой иммунорезистентностью.
Это больные СПИДом, недоношенные
младенцы, больные раком, прошедшие
радиотерапию. Ведутся клинические
испытания такого молока. Уже
сейчас корпорация Genzyme Transgenics планирует
исследования с целью создания трансгенного
крупного рогатого скота, содержащего
в молоке человеческий альбумин. Был куплен
патент на получение эмбрионов, содержащих
геном клеток соединительной ткани (фибробластов),
включающий ген, ответственный за синтез
человеческого белка. Подобная технология
позволяет увеличить эффективность создания
трансгенных молочных животных, так как
при обычном впрыскивании генов в оплодотворенную
яйцеклетку рождается от только 5 – 10% трансформированных
животных, из них – несколько самцов, не
дающих молока.
Использование новой
технологии клонирования позволяет
получать животных только женского
пола, дающих трансгенный протеин.
Альбумин используется в терапии
для поддержания осмотического
давления в крови. Ежегодно
в мире требуется около 440 тысяч
литров плазмы крови для выделения
этого белка (стоимость около
1,5 млрд. $). Каждая молочная корова
может произвести 80 кг рекомбинантного
человеческого альбумина ежегодно.
Genzyme Transgenics занимается разработкой аналогичных
методов получения человеческого гормона
роста и β-интерферона.
В Англии созданы
трансгенные овцы, молоко которых
содержит фактор свертывания
крови.
В нашей стране были
попытки создать овец, продуцирующих
химозин (фермент для сыроварения).
Было получено 2 овцы, у одной –
ген не экспрессировался, у второй
содержание химозина достигало
300 мг/л. Однако потомство этой
овцы давало низкие удои –
порядка 50 кг за период лактации.
Причина заключалась в том,
что химозин вырабатывается в
виде предшественника – прохимозина,
который превращается в активный
фермент при рН=5. Было запланировано
получать именно прохимозин, но
в каких-то участках вымени
происходило снижение рН, что
приводило к активации химозина
непосредственно в организме.
Активный химозин свертывал молоко,
а оно закупоривало протоки
вымени. Сейчас пытаются решить
эту проблему.
В Подмосковье получены
кролики, выделяющие γ-интерферон,
эритропоэтин, но кролики не являются
традиционными продуцентами молока. Эксперименты
же по трансформации сельскохозяйственных
животных очень дорогостоящи – одно трансгенное
животное стоит десятки и сотни тысяч
долларов.
Трансгенных животных
получают и для целей ксенотрансплантации.
Одним из излюбленных доноров
органов являются свиньи, так
как имеется анатомическое сходство
органов и сходство иммунологических
свойств. Реакции отторжения при
трансплантации имеют сложный
механизм. Одним из сигналов для
атаки организма на чужой орган
являются белки, локализованные
на внешней поверхности мембраны.
У трансгенных свиней эти белки
заменены на человеческие.
Еще одно направление
трансгеноза – получение устойчивых
к болезням животных. Животноводство
держится на вакцинах, так как
селекция ведется преимущественно
на хозяйственно ценные признаки
– шерстистость, молочность и
т. д. Повышение устойчивости
– дело генных инженеров. К
защитным белкам относятся интерфероны,
поэтому ген интерферона встраивали
различным животным. Трансгенные
мыши получили устойчивость, они
не болели или болели мало,
а вот у свиней такого эффекта
не обнаружено.
Другое направление
– введение генов, кодирующих
антисмысловую РНК. Для животноводства
острой проблемой являются лейкозы,
вызываемые РНК-вирусами. Трансгенные
кролики, несущие гены, отвечающие
за присутствие в клетке антисмысловой
РНК, были устойчивы к лейкозам.
Трансгенных животных
можно использовать для изучения
наследственных заболеваний мозга
и нервной системы. Гены болезни
Альцгеймера (отложение белка
β-амилоида приводит к образованию характерных
бляшек) и гены, отвечающие за развитие
эпилепсии, болезней мозга вводятся в
геном нормальных животных; при этом получают
трансгенных животных-моделей, на которых
можно испытывать различные терапевтические
приемы.
Трансгенных животных
стали использовать для исследования
воспалительных и иммунологических
заболеваний человека, например, ревматоидного
артрита. Моделируются болезни,
связанные с липидным обменом.
Заключение
Хотя генетика и
генная инженерия уже играют
огромную роль в медицине и
сельском хозяйстве, основные
результаты ещё впереди. Нам
ещё очень многое предстоит
узнать о том, как работает
сложная генетическая система
в нашем организме и у других
видов живых существ.
Необходимо определить
функции и назначение каждого
гена, определить, каковы условия
его активации, в какие периоды
жизни, в каких частях тела
и при каких обстоятельствах
он включается и приводит к
синтезу соответствующего белка.
Далее, необходимо понять, какую
роль играет в организме этот
белок, выходит ли он за пределы
клетки, какие сообщения несёт,
какие реакции катализирует, как
влияет на запуск биологических
процессов в других частях
организма, какие гены активирует.
Отдельной сложной задачей является
решение проблемы сворачивания
белков – как, зная последовательность
аминокислот, составляющих белок,
определить его пространственную
структуру и функции. Эта проблема
требует новых теоретических
знаний и более мощных суперкомпьютеров.
Но учёные не пасуют
перед масштабом этой задачи.
Расшифровка генома человека
потребовала более десяти лет,
решение проблемы сворачивания
белков может занять чуть дольше,
но когда она будет решена,
человек сможет полностью контролировать
жизненные процессы в любых
организмах на всех уровнях.
Список литературы
1. Албертс Б., Брей Д., Льюис
Дж. и др. Молекулярная биология
клетки. Т. 1 – 3. М.: Мир, 1994.
Реферат: методы переноса генетического материала в клетки млекопитающих – – банк рефератов, сочинений, докладов, курсовых и дипломных работ
Введение
Все
эксперименты
по переносу
генетического
материала
состоят из двух
отдельных
этапов: переноса
ДНК от донора
к реципиенту
и отбора реципиентных
клеток, которые
включили генетический
материал донора.
Большинство
соответствующих
методов позволяют
ввести чужеродный
материал в одну
клетку из тысячи,
а то и десяти
миллионов,
поэтому для
отбора нужны
весьма эффективные
средства. Именно
эта стадия
зачастую является
лимитирующей
в ходе эксперимента.
Первые
опыты по переносу
генетического
материала
осуществляли
с помощью слияния
целых клеток.
Такая техника
нашла применение
при изучении
процессов
дифференцировки
и канцерогенеза,
однако наиболее
успешно ее
использовали
при картировании
генов человека
и получении
моноклональных
антител. Известно,
что сформировавшийся
при слиянии
клеток грызуна
и человека
межвидовой
гибрид спонтанно
теряет человеческие
хромосомы. Как
правило, утрата
хромосом происходит
случайным
образом, и это
позволяет
конструировать
гибридные линии
клеток, в которых
содержатся
разные хромосомы
человека. Корреляция
между присутствием
конкретной
хромосомы
человека и
экспрессией
генетического
маркера является
основой для
отнесения
соответствующего
гена к определенной
группе сцепления.
Из 1300 генов человека,
картированных
на сегодняшний
день, примерно
треть локализована
на конкретных
хромосомах
с помощью методов
генетики соматических
клеток. Процесс
утраты хромосом
у внутривидовых
гибридов происходит
не так быстро,
как у гибридов
межвидовых.
При слиянии
клеток мышиной
миеломы с клетками
селезенки
формируются
стабильные
линии гибридных
клеток. Их
характеризует
иммортальность,
унаследованная
от миеломных
клеток, и способность
продуцировать
антитела.
Хромосомная
нестабильность
межвидовых
гибридов, сложности
при кариотипировании
тетраплоидных
внутривидовых
гибридов ограничивали
применение
методов генетики
соматических
клеток для
генетического
анализа сложных
фенотипов.
Необходимо
было научиться
переносить
отдельные
хромосомы между
соматическими
клетками. Это
удалось сделать
с помощью
мини-клеток.
Несмотря на
технические
трудности,
метод MMGT
с успехом
использовали
для создания
гибридов и
последующего
картирования
генов, для анализа
процессов
дифференцировки
и развития
опухоли. Такие
эксперименты
позволили с
уверенностью
говорить о
существовании
специфических
^rans-действующих
регуляторов,
участвующих
в формировании
фенотипа
дифференцированной
клетки; кроме
того, был подтвержден
рецессивный
характер гена
опухоли Вильмса.
Методы
слияния целых
клеток и MMGT
эффективны
для хромосомной
локализации
гена, возможность
более тонкого
картирования
этими методами
ограничена,
так как оно
требует наличия
хромосом с
транслокациями
и делециями.
Для решения
этой задачи
разработаны
два метода:
перенос генов,
опосредованный
хромосомой,
и перенос генов
в процессе
слияния облученной
клетки-донора
с необлученным
реципиентом.
Первый способ
предполагает
инкубацию
очищенных
митотических
хромосом с
клетками-реципиентами
в присутствии
фосфата кальция.
При этом происходит
встраивание
фрагментов
донорных хромосом
в хромосомы
клетки-реципиента.
Для идентификации
гибридов, содержащих
нужные фрагменты
ДНК донора,
применяют
соответствующие
методы селекции.
К сожалению,
встроенные
фрагменты
хромосом зачастую
претерпевают
реорганизацию,
кроме того,
есть достоверные
данные о предпочтительном
проникновении
в клетку и
последовательностей
из центромерных
областей. Эти
недостатки
не позволяют
использовать
CMGT
для картирования,
хотя данный
метод весьма
эффективен
для обогащения
специфическими
фрагментами
хромосом –
составной части
стратегии
клонирования,
называемой
«обратной
генетикой».
Госс и Харис
впервые показали,
что фрагменты
Х-хромосомы
человека,
появляющиеся
в его гамма-облученной
клетке, можно
сохранить при
слиянии этой
клетки с клеткой
грызуна. Углубленный
анализ метода
IFGT
показал, что
полученные
фрагменты
реорганизованы
и для них характерна
та же тенденция
представлять
центромерные
области, что
и при CMGT.
Геномную
ДНК можно ввести,
добавляя ее
очищенный
препарат к
реципиентным
клеткам. Эта
процедура также
очень важна
для анализа
функционирования
генов в клетках
млекопитающих.
Разработаны
три способа
введения ДНК:
преципитация
с фосфатом
кальция, с помощью
ретровирусного
вектора и
микроинъекция.
Вероятно, для
каждого из них
существует
предельный
размер фрагментов
ДНК, которые
переносятся
без повреждения.
Хотя эту гипотезу
не подвергали
тщательной
проверке, скорее
всего дело
обстоит именно
так. Фрагменты
длиной более
100 тысяч пар
оснований вряд
ли можно перенести
без потерь,
если это вообще
возможно. Метод
DMGT
кроме функциональных
исследований
используют
для случайного
встраивания
в геном селектируемых
генов и для
клонирования
генов, при селекции
которых необходима
экспрессия.
1.
Общие
положения
1.1
Необходимые
условия
Условия
культивирования
клеток должны
обеспечивать
их максимальную
жизнеспособность.
Это особенно
важно для клеток,
используемых
в эксперименте
по переносу,
поскольку
данная процедура
предполагает
использование
потенциально
токсичных
веществ, таких,
например, как
полиэтиленгликоль.
Успех
экспериментов
по генетическому
переносу во
многом определяется
эффективностью
посева клеток-реципиентов.
Следовательно,
эффективность
посева всех
клеточных
линий, которые
будут использованы
в качестве
реципиентов,
должна быть
проверена в
условиях, аналогичных
экспериментальным.
Линии, демонстрирующие
эффективность
посева менее
10%, не годятся
на роль реципиента.
Все
манипуляции
необходимо
проводить в
стерильных
условиях и со
стерильными
реагентами.
Растворы следует
готовить только
из реактивов,
предназначенных
для культивирования
клеток, обязательно
использовать
для этого
бидистиллированную
воду.
1.2
Селекция
Цель
селекции –
предоставление
определенных
преимуществ
клеткам, необходимым
экспериментатору.
Существуют
четыре группы
методов селекции.
1.2.1
Биохимическая
селекция, основанная
на эндогенных
генах
Наиболее
широко распространенный
пример такого
подхода –
НАТ-селекция.
В присутствии
аминоптерина
ингибируется
синтез de
novo
предшественников
ДНК. Клетки,
лишенные фермента
тимидинкиназы,
не могут утилизировать
экзогенный
тимидин и гибнут
в присутствии
аминоптерина.
Аналогично,
клетки, лишенные
гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы,
не могут усваивать
гипоксантин
и также нежизнеспособны
в присутствии
аминоптерина.
Соматические
гибриды, полученные
при слиянии
ТК-,
НРКТ -кле-ток
с клетками ТК ,
HPRT-,
могут оказаться
одновременно
ТК ,
HPRT .
Гибридные
клетки с таким
генотипом
способны расти
в присутствии
аминоптерина,
если гипоксантин
и тимидин добавлены
в среду. Распространен
вариант НАТ-метода,
когда один
партнер по
гибридизации
не может размножаться
in
vitro,
а другой – является
дефицитным
по ТК или HPRT.
Для исследований
в области генетики
соматических
клеток разработано
большое количество
систем комплементации.
Многие из них
основаны на
использовании
различных
ауксотрофных
и прототрофных
клеточных линий
хомячков. Этот
подход требует
создания подходящих
мутантных
клеток-реципиентов.
Учитывая
важность
НАТ-селекции,
мы предлагаем
вниманию читателей
руководство
по приготовлению
соответствующей
среды.
1.2.2
Биохимическая
селекция, основанная
на экзогенных
генах
Этот
подход избавляет
нас от необходимости
выделять
специфический
мутант, поскольку
он подразумевает
использование
бактериальных
генов, которые
дают селективные
преимущества
при их экспрессии
в клетках
млекопитающих.
Для этого
конструируют
плазмидные
и ретровирусные
векторы, в которых
бактериальные
гены сочетаются
с промоторами,
местами сплайсинга
и сигналами
полиаденилирования
млекопитающих.
Введение
бактериальных
генов в клетки
млекопитающих
с помощью трансфекции
или инфекции
приводит к их
случайному
распределению
в геноме реципиента.
В качестве
примера бактериальных
генов, способных
обеспечивать
селективные
преимущества
клеток млекопитающих,
можно назвать
ген Е.
coli
gpt
и генлео. Основной
недостаток
этого метода
– случайное
распределение
сайтов интеграции;
однако последние
исследования
позволяют
надеяться, что
с помощью
гомологичной
рекомбинации
удастся осуществлять
направленную
интеграцию.
1.2.3
Антигены клеточной
поверхности
В
роли селективного
фактора могут
выступать
антитела. При
этом мы получаем
возможность
выделять клетки
с определенным
набором антигенов
клеточной
поверхности.
Применение
антител лежит
в основе ряда
методов, среди
них отбор клеток
с помощью клеточного
сортера, розеткообразование
с эритроцитами,
связанными
антителами,
избирательное
прикрепление
клеток к поверхности
с иммобилизованными
на ней антителами.
Хотя эффективность
селекции клеток
с помощью антител
недостаточно
высока, тем не
менее селекция
с использованием
антител применяется
во всех методах
переноса генов,
описываемых
здесь, за исключением
MMGT.
1.2.4
Активированные
онкогены
Мутировавшие
протоонкогены,
особенно члены
семейства
ras-генов,
обеспечивают
преимущества
в росте клеток
млекопитающих
и, следовательно,
могут быть
использованы
для селекции.
2.
Слияние целых
клеток
2.1
Введение
Известно,
что при смешивании
клеток они
могут спонтанно
сливаться,
однако событие
это чрезвычайно
редкое. Эффективность
слияния может
быть существенно
увеличена с
помощью специфических
антигенов.
Первоначально
для этой цели
использовали
инактивированный
вирус Сендай,
однако биологическая
неоднородность
различных
партий инактивированного
вируса и громоздкость
процедуры
слияния, индуцированного
вирусом, привели
к широкому
использованию
химического
индуктора–полиэтиленгликоля.
Метод, представленный
ниже, пригоден
для слияния
клеток как
одного, так и
разных видов
животных.
Внутривидовые
гибриды формируются
с частотой
10~5–Ю-3.
Частота слияния
клеток разных
видов варьирует
от 10~7
до 10~5.
Клетки, имеющие
сходные фенотипы
и близкие параметры
роста, сливаются
с более высокой
частотой.
2.2
Получение
клеточных
гибридов с
помощью слияния,
индуцированного
ПЭГ
Таблица
2. Основные растворы,
необходимые
для слияния
клеток
Среда Среда | Обычно мы используем среду Игла, модифицированную Дульбекко, с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки, однако состав культуральной среды прямо на процесс слияния не влияет |
| Селективная среда | Культуральная среда, пригодная для селекции гибридных клеток |
| 50%-ный раствор ПЭГ, приготовленный в бессывороточной среде | 5,5 г ПЭГ 4000 н 5 мл бессывороточной среды смешивают и авто-клавируют. Конечный рН доводят до 8,2, раствор нагревают до 37 °С непосредственно перед использованием |
2.3
Возможные
ошибки и варианты
методики
Некоторые
линии клеток
сливаются с
трудом,
если же все-таки
необходимы
именно такие
комбинации,
попытайтесь
сделать следующее.
1.
Варьируйте
соотношение
родительских
клеток в диапазоне
1:10–10:1.
2.
Попробуйте
разный ПЭГ:
а)
поменяйте
партию ПЭГ. В
наших экспериментах
та партия ПЭГ,
которая давала
хорошие результаты
при слиянии
одного типа
клеток, эффективно
работала и с
другими. Хорошо
зарекомендовавший
себя препарат
необходимо
отделить и
аккуратно
хранить. По
некоторым
данным свойства
ПЭГ могут быть
улучшены
использованием
растворов, не
содержащих
солей кальция;
б)
варьируйте
молекулярный
вес. Как правило,
повышение
молекулярного
веса влечет
за собой увеличение
способности
индуцировать
слияние. Однако
раствор ПЭГ
с большим
молекулярным
весом обладает
большей вязкостью,
что затрудняет
отмывку клеток.
Так как ПЭГ
является
Для
каждой конкретной
клеточной линии
необходимо
подобрать
оптимальную
концентрацию
колцемида и
время экспозиции.
Образование
мини-клеток
легко контролируется
под фазово-контрастным
микроскопом.
В удачных
экспериментах
около 50% всех
клеток образуют
мини-клетки.
Эта частота
увеличивается
после обработки
цитохала-зином
В.
Второй
день
3.
Спустя 16 ч
замените
среду на среду,
содержащую
цитоха-лазин
В в концентрации
2 мкг/мл; инкубируйте
в течение ночи.
4.
Исходные градиентные
растворы поместите
в сосуды с неплотно
завинченными
крышками и
инкубируйте
в атмосфере
5% СОг при 37 °С в
течение ночи.
5.
Заранее нагрейте
ротор SW41.
Третий
день
6.
Приготовление
ступенчатого
градиента
фиколла. Тщательно
промойте необходимое
количество
центрифужных
пробирок для
ротора SW41
абсолютным
спиртом, высушите
в перевернутом
положении в
ламинарном
боксе. Приготовьте
градиент фиколла,
используя
уравновешенные
исходные растворы.
7.
Соберите обработанные
колцемидом
и цитохалазином
клетки и осадите
их центрифугированием.
Ресуспендируйте
в 3 мл 10%-ного фиколла
и мягко наслоите
на
градиент.
Заполните
центрифужные
пробирки раствором
без фиколла.
8.
Поместите
пробирки, содержащие
градиент, в
нагретый ротор
SW41
и
поставьте
ротор
в заранее
нагретую до
37 °С ультрацентрифугу.
9.
Центрифугируйте
1 ч
при 25000
об/мин при 37 °С;
используйте
минимальное
ускорение при
разгоне и минимальное
торможение,
чтобы предотвратить
разрушение
градиента.
10.
Выньте пробирки
из центрифуги.
Мини-клетки
образуют рыхлые
полоски в градиенте
между
15:16% и 16:17% фиколлом.
Осторожно
отберите эти
полоски, используя
стерильную
пастеровскую
пипетку, вводя
ее
через верх
градиента;
поместите
мини-клетки
в новую, стерильную
центрифужную
пробирку от
ротора SW41
и заполните
ее средой для
роста клеток.
Загрязнение
фрагментами
цитоплазмы,
ядрами и целыми
клетками можно
контролировать
под фазово-контрастным
микроскопом.
11.
Центрифугируйте
при 20 000 об/мин при
комнатной
температуре
в роторе SW41
10 мин при максимальном
ускорении и
торможении.
Эта процедура
осаждает мини-клетки
и отделяет их
от фиколла.
12.
Для дальнейшей
очистки мини-клеток
мы предлагаем
три различных
приема. Очистка
не нужна, лишь
когда в распоряжении
исследователей
имеется четкая
система селекции.
В этом случае
они могут сразу
использовать
мини-клетки
для слияния
с
клетками-реципиентами.
13.
Слияние мини-клеток
с целыми клетками.
Соберите
клетки-реципиенты
и отмойте их
бессывороточной
средой. Добавьте
приблизительно
107
клеток-реципиентов
к осадку мини-клеток
в 2 мл бессывороточной
ростовой среды,
содержащей
100 мкг/мл фитогемагглютинина.
Поместите в
пластиковый
сосуд с
коническим
дном и инкубируйте
10 мин при 37 °С.
14.
Осадите центрифугированием.
15.
Процедуру
слияния мини-клеток
с целыми клетками
проводите с
помощью ПЭГ,
как указано
в соответствующей
методике.
3.
Перенос генов,
опосредованный
хромосомами
JCMGTJ
3.1Введение
Метод
CMGT
может быть
использован
для переноса
фрагментов
хромосом из
ядер клеток
одного типа
в ядра клеток
другого типа.
Теоретически
клетки любого
типа могут быть
использованы
как в качестве
доноров, так
и в качестве
реципиентов
хромосом.
Однако
на
практике
возможность
применения
метода
определяется
наличием подходящих
реципиентных
линий, обладающих
повышенной
способностью
акцептировать
чужеродную
ДНК.
Высокая
частота трансфекции
может быть
достигнута
при использовании
в качестве
реципиентов
иммортализованных
мышиных
клеток.
Клеткам
хомячка и
иммортализованным
человеческим
клеткам обычно
присуща более
низкая частота
трансфекции.
Правда, недавно
полученные
результаты
свидетельствуют
о том, что человеческие
клетки линии
EJ
способны
трансфицироваться
с высокой частотой.
В роли донора
с одинаковым
успехом могут
выступать самые
разнообразные
клеточные линии
– как суспензионные,
так и субстрат-зависимые.
Предпочтительнее
использовать
в качестве
донорных те
линии, клетки
которых легче
культивировать
и получать в
больших количествах.
Ниже описываются
общие процедуры,
обеспечивающие
выделение
донорных хромосом
и перенос фрагментов
этих хромосом
в реципиентные
клетки путем
CMGT.
3.2
Выделение
хромосом
В
ходе описываемых
процедур для
предотвращения
потерь и поломок
хромосом, для
обеспечения
температурного
режима необходимо
использовать
пластиковые
пипетки и пробирки.
Клетки блокируют
на стадии митоза,
митотические
хромосомы
высвобождают
воздействием
гипотонического
шока и гомогенизацией.
Хромосомы
очищают дифференциальным
центрифугированием.
Таблица.
Исходные растворы
на CMGT
Среда | NB. |
Гипотонический | 10 |
Раствор | 25 |
1,25 | 25 5 0,7 |
3.3
Перенос
хромосом
Процесс
переноса хромосом
в этом случае
очень напоминает
описываемый
в методе DMGT.
Хромосомы
осаждают на
поверхности
клеток хлоридом
кальция, и спустя
несколько часов
клетки обрабатывают
реагентом,
способным
перфорировать
мембраны. Здесь
тоже важно
использовать
пластиковые
пробирки и
пипетки. Последовательность
действий, которая
приведена ниже,
разработана
Нельсоном.
1.
За день перед
проведением
трансфекции
высейте по 5Х
Х105
клеток на 10 чашек
диаметром 9 см.
Используйте
низкофосфатную
среду, например
DMEM.
2.
Ресуспендируйте
108
хромосом в 9 мл
раствора для
трансфекции.
3.
Медленно добавьте
к хромосомам
1 мл 1,25 М раствора
СаС12,
одновременно
продувая воздух
через суспензию
хромосом.
4.
Инкубируйте
20–30 мин при
комнатной
температуре
для: образования
смеси фосфат
кальция – ДНК.
5.
Добавьте
по 1 мл этой смеси
к среде в каждую
чашку с реципиентными
клетками. Инкубируйте
клетки с хромосомами
4–6 ч
в увлажняющем
инкубаторе
при 37 °С.
6.
Удалите
среду и добавьте
10 мл отмывочного
раствора.
7.
Удалите
отмывочный
раствор и обработайте
клетки 1 мл среды
для глицеринового
шока в течение
4 мин при комнатной
температуре.
8.
Отмойте клетки
3 раза промывочным
раствором и
инкубируйте
в течение ночи
в неселективной
среде для роста
клеток.
9.
Через 24 ч поменяйте
среду на селективную.
Меняйте среду
на свежую каждые
3–4 дня.
10.
Колонии появятся
на 14–21-й день.
3.4
Предварительная
селекция
При
использовании
DMGT
донорная геномная
ДНК обычно
переносится
вместе с плазмидой,
кодирующей
доминантный
селективный
маркер. Предварительная
селекция, выявляющая
включение
плазмидной
ДНК, позволяет
получить 100-кратное
обогащение
клетками, содержащими
интересующий
нас клеточный
ген. Аналогичный
прием может
быть использован
и в CMGT.
Для проведения
котрансфекции
необходимое
количество
плазмидной
ДНК добавляют
к суспензии
хромосом перед
преципитацией
хлоридом кальция.
Обычно мы добавляем
плазмидную
ДНК в количестве,
достаточном
для достижения
соотношения
20:1. Селекцию
проводим спутся
24 ч после хромосомной
трансфекции.
3.5
Возможные
ошибки и варианты
методики
В
литературе
описано множество
методов выделения
хромосом из
клеток, блокированных
в метафазе.
Процедуры
очистки тоже
разнообразны.
Одни из них
позволяют
получить
высокоочищенные
препараты,
другие–грубую
фракцию хромосом,
загрязненную
разными компонентами
клетки. Мы
предпочитаем
использовать
для проведения
трансфекции
именно такие
грубые препараты,
во-первых, потому
что их получение
занимает мало
времени, а во-вторых,
потому что
хромосомы при
этом оказываются
наименее
разрушенными.
Анализ,
проведенный
Льюисом, показал,
что существует
линейная зависимость
частоты CMGT-трансфекции
от дозы донорных
хромосом. В
большинстве
последующих
экспериментов
исследователи
старались
ввести в клетку
как можно больше
хромосом. Однако
на практике
количество
хромосом, которое
можно получить,
ограничено.
Основное препятствие
в использовании
очень большого
количества
донорных клеток
– это высокая
вязкость суспензии
хромосом, которая
способствует
их агглютинации.
Вот почему мы
добавляем не
более 20 хромосом
на одну реципиентную
клетку. Помимо
механического
воздействия
для получения
препарата
хромосом можно
применять и
химическую
обработку,
включая использование
мягких детергентов,
таких, как дигитонин.
Исходя
из нашего опыта,
можно заключить,
что результаты
трансфекции
воспроизводимы.
В некоторых
случаях может
оказаться
необходимым
оптимизировать
условия «шока»,
варьируя концентрацию
глицерина и
время инкубации.
Обсуждение
способа трансфекции
с помощью осаждения
фосфатом кальций
приводится
в разд. 6.
При
использовании
метода CM.GT
образуются
реципиентные
клетки, содержащие
фрагменты
донорных хромосом:
в некоторых
случаях они
встраиваются
в геном реципиента,
иногда реплицируются
самостоятельно.
Невозможно
выделить параметр,
контролирующий
размеры передаваемого
фрагмента, и
в большинстве
экспериментов
получаются
клоны, содержащие
донорный материал
в широком диапазоне.
Мы детально
анализировали
введенные
фрагменты во
всех случаях.
В них наблюдались
перестройки:
это либо внутренние
делеции, либо
переобогащение
альфоидными
последовательностями
из области
центромеры.
Внутренние
делеции описаны
также другими
авторами.
4.
Перенос
генов, опосредованный
ДНК
4.1
Введение
В
настоящее время
разработано
большое количество
методов для
введения
клонированных
последовательностей
ДНК в клетки
млекопитающих.
Среди них
преципитация
фосфатом кальция
или DEAE-декстраном,
электропробой,
использование
инактивированных
вирусов и слияние
прокариотических
и дрожжевых
протопластов
с клетками
млекопитающих.
Наиболее широкое
распространение
получила преципитация
фосфатом кальция.
Точный механизм
захвата ДНК,
ее включения
в реципиентную
клетку непонятен,
однако известно,
что лишь небольшое
количество
клеток в культуре
реципиентов
включают ДНК.
По аналогии
с бактериальной
генетикой эти
клетки получили
название
«компетентных».
Количество
включаемой
ДНК – важнейшая
характеристика
используемой
клеточной
линии. Мышиные
L-клетки
включают несколько
миллионов пар
оснований
экзогенной
ДНК, человеческие
фибробласты
– только часть
этого количества.
Было проведено
несколько
экспериментов
по выявлению
максимальных
размеров ДНК,
передаваемой
неповрежденной.
Обычно не удается
перенести
интактную ДНК,
размеры которой
превышают 100
т. п. н. Неизвестно,
зависит ли это
от свойств
клеток-реципиентов
или определяется
трудностями
в получении
таких больших
фрагментов
ДНК интактными.
Недавние успехи
в получении
высокомолекулярных
фрагментов
ДНК позволяют
проанализировать
оба этих варианта.
4.2
Трансфекция
ДНК с использованием
фосфата кальция
Таблица.
Растворы для
DMGT
Среда | Используйте низкофосфатную среду для роста |
| клеток, такую, как DMEM | |
| Селективная среда | |
| 2хНереэ-буфер | рН очень важен и должен быть проверен, если |
| раствор длительно хранился | |
рН | 50 мМ Hepes |
| 290 мМ хлорида натрня | |
| 1,5 мМ фосфата натрия (равное количество гидро- | |
| и дигидрофосфата) | |
| 1XHBS | 25 мМ Hepes |
| 145 мМ хлорида натрия | |
| 0,75 мМ фосфата натрия (равное количество гидро- | |
1,25 | и дигидрофосфата) |
| Раствор для глицерино- | 15% |
| вого шока |
4.3
Совместный
перенос и
предварительная
селекция
Известно,
что компетентные
клетки способны
включать большое
количество
донорной ДНК,
причем одна
реципиентная
клетка может
включать несколько
разных молекул
донорной ДНК
в один геномный
сайт. Этот феномен
позволяет
выделять компетентные
субпопуляции
из общей массы
реципиентных
клеток и маркировать
геном млекопитающих.
Если донорная
ДНК смешана
с плазмидной,
кодирующей
селективный
для клеток
млекопитающих
маркер, селекция
по плазмидному
гену после
трансфекции
позволяет
выделить популяцию
трансфицированных
клеток. Такое
обогащение
облегчает
дальнейшую
очистку реципиентных
клеток. Этот
прием оказался
успешным при
клонировании
генов, кодирующих
клеточные
поверхностные
антигены. В
данном случае
для обогащения
использовали
антитела, а для
разделения
субпопуляций
клеток флуоресцентный
сортер.
В
реципиентных
клетках ДНК
плазмиды, содержащей
селективный
маркер, лигируется
с донорной
геномной ДНК.
Это приводит
к «маркированию»
последовательности
ДНК клетки
млекопитающего
и может упростить
выделение
донорного гена
после нескольких
повторных
трансфекции.
В
опытах по
котрансфекции
мы использовали
смесь из 1 мкг
плазмидной
и 20 мкг геномной
ДНК. Смесь готовили
непосредственно
перед добавлением
хлорида кальция.
4.4
Возможные
ошибки и варианты
методики
Не
все клетки
способны к
трансфекции
геномной ДНК
с высокой частотой.
Одни клетки
вообще не
трансфицируются,
другие, например
человеческие
фибробласты,
способны эффективно
включать плазмидную
ДНК и почти не
включать геномную
ДНК – Мышиные
L-клетки
обладают способностью
к трансфекции
геномной ДНК
с высокой частотой
и могут быть
использованы
в качестве
положительного
контроля в
экспериментах
по трансфекции
ДНК новыми
клеточными
линиями. Возможно,
что альтернативные
способы прямого
включения
геномной ДНК,
такие, как
электропробой
или липосомный
перенос, смогут
расширить
список клеточных
линий, способных
к трансфекции.
В противовес
общепринятому
мнению мы получали
хорошие результаты
по трансфекции
L-клеток,
используя
преципитацию,
при которой
образовывался
осадок как в
виде слабо
опалесцирующей
суспензии, так
и в форме агрегатов.
Тем не менее,
конечно, предпочтительнее
соблюдать
условия, при
которых формируется
гомогенный
осадок.
Глицериновый
шок увеличивает
частоту трансфекции
в 2–
5
раз. Оптимальные
условия проведения
шока для разных
клеток варьируют.
В каждом новом
случае необходимо
подбирать как
концентрацию
глицерина, так
и время инкубации.
Эффективность генетической трансформации соматических и эмбриональных клеток животных с использованием различных типов клеток-"упаковщиц"
1. Абдурахманов И.К. Характеристика линий клеток, упаковывающих рекомбинантные ретровирусные векторы, в переносе экзогенной ДНК в клетки млекопитающих: автореф. дисс. канд. биол. наук. / И.К.Абдурахманов – Дубровицы, 2001. – 22 с.
2. Брем Г. Генные фермы новый путь производства биологически активных протеинов трансгенными животными /Г. Брем, H.A. Зиновьева, JI.K. Эрнст // Сельскохозяйственная биология.- 1993.- № 6.- С. 3-27.
3. Брем Г. Экспериментальная генетика в животноводстве / Г. Брем, X. Кройслих, Г. Штранцингер -М: РАСХН, 1995. 326 с.
4. Волкова JI.A. Методические вопросы цитогенетики птицы / J1.A. Волкова, П.В. Ларионова, П.М. Кленовицкий, H.A. Волкова, H.A. Зиновьева -Дубровицы: ВИЖ, 2004. 22с.
5. Волкова H.A. Интеграция и экспрессия экзогенов в молочной железе соматических трансгенных животных, полученных с использованием ретровирусных векторов: автореф. дисс. канд. биол. наук. / H.A. Волкова -Дубровицы, 2002. 22 с.
6. Горбунова В.Н. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний / В.Н. Горбунова, B.C. Баранов -СПб.: Специальная литература, 1997. 287 с.
7. Гвоздь И.М. Экспрессия рекомбинантных белков в молоке трансгенных животных: автореф. дисс. канд. биол. наук. / И.М. Гвоздь -Дубровицы, 2003. 22 с.
8. Зиновьева Н. А. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве / H.A. Зиновьева, А.Н. Попов, Л.К. Эрнст, Н.С. Марзанов, В.В. Бочкарев, Н.И. Стрекозов, Г.Брем Дубровицы: ВИЖ, 1998.- 47 с.
9. Зиновьева H.A. Трансгенные кролики как продуценты химозина крупного рогатого скота с молоком / H.A. Зиновьева, У. Безенфельдер, М. Мюллер, J1.K. Мюллер, JI.K. Эрнст, Г. Брем // Биотехнология. 1998.- С.17-31.
10. Зиновьева H.A. Трансгенные животные и возможности их использования: молекулярно-генетические аспекты трансгенеза в животноводстве / H.A. Зиновьева, J1.K. Эрнст, Г. Брем Дубровицы: ВИЖ, 2001.-128 с.
11. Зиновьева H.A. Проблемы биотехнологии и селекции сельскохозяйственных животных / H.A. Зиновьева, JI.K. Эрнст. Дубровицы: ВИЖ, 2004.-316с.
12. Новое в клонировании ДНК. Методы. / Под ред. Д. Гловера. М.: Мир, 1989. – 368 с.
13. Прасолов B.C. Ретровирусные векторы эффективная система переноса и экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих / В.С.Прасолов // Молекулярная биология. – 1989. – Т.23, вып.2. – С.8-12.
14. Сингер М. Гены и геномы / М. Сингер, П. Берг М.: Мир, 1998. -Т.2.- 362 с.
15. Спиер P.E. Биотехнология клеток животных / P.E. Спиер, Г.Д.Адаме, Дж.Б. Гриффите М.: Агромпромиздат, 1989. – 520 с.
16. Сюрин В.Н. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин -М.:ВНИТИБП, 1998.-С.363-460.
17. Титова В.А. Молекулярно-генетические аспекты использования ретровирусных векторов для трасгенеза в животноводстве: автореф. дисс. канд. биол. наук. / В.А. Титова. Дубровицы, 2001. – 22 с.
18. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. 4.2. / С.Н. Щелкунов -Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та, 1997. 400с.
19. Эрнст J1.K. Некоторые аспекты использования ретровирусных векторов для переноса чужеродной ДНК in vivo и in vitro / JI.K. Эрнст, H.A. Зиновьева, H.A. Волкова, B.A. Титова M.: РАСХН, 2003.-84 с.
20. Эрнст J1.K. Современное состояние и перспективы использования трансгенных технологий в животноводстве / J1.K. Эрнст, Н.А. Зиновьева, Г.Брем М.: РАСХН, 2002.-341с.
21. Эрнст J1.K. Биотехнология сельскохозяйственных животных / Л.К.Эрнст, М.И. Прокофьев-М.: Колос, 1995.-192с.
22. Aaronson S.A. Endogenous type-C RNA viruses of mammalian cells / S.A. Aaronson, J.R. Stephenson // Biochim. Biophys. Acta. 1976. – 458, 323354.
23. Blake J. Beta geo, a combined selection and reporter gene for retroviral and transgenic studies / J. Blake, P.S. Salinas, S.M. Hughes // Biotechnigues. 1997. – 23(4), 690-695.
24. Borwornpinyo S. Germ-line transmission of a lacZ gene in chickens using an avian Spleen Necrosis Virus-based vector / S. Borwornpinyo, D.W.McCoy, P.E. Mozdziak, J.N. Petitte // J. Anim. Sci. 1998. – 79 (1), 174.
25. Bosselman R.A. Germline transmission of exogenous genes in the chicken / R.A. Bosselman, R.Y. Hsu, T. Boggs, S. Hu, J. Bruszewski, S. Ou,
26. Kozar, F. Martin, C. Green, F. Jacobsen // Science.- 1989. 243 (4890), 533535.
27. Brazolot C.L. Efficient transfection of chicken cells by lipofection, and introduction of transfected blastodermal cells into the embryo / C.L. Brazolot, I.N.Petitte, R.I. Etches, A.M. Verrinder Gibbins // Mol. Reprod. Dev.- 1991.- 30, 304-312.
28. Brem G. Produktion of transgenic mice, rabbits and pigs by mikroinjektion into pronuclei / G. Brem, B. Brenig, H.M. Goodman, R.S. Selden, F.Graf, B. Kruff// Zuchthygiene.- 1985.-20, 251-252.
29. Brinster R.L. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs / R.L. Brinster, H.Y. Chen, M.E. Trumbauer // Proc. Natl Acad. Sci. USA.- 1985. 82, 4438^442
30. Carsience R.S. Germline chimeric chickens from dispersed donor blastodermal cells and compromised recipient embryos / R.S. Carsience, M.E.Clark, R.I. Etches, A.M. Verrinder Gibbins // Development.- 1993.- 117, 669-675.
31. Carver A.S. Transgenic liverstock as bioreactors: stable expression of human alfa-l-antitripsin by a flock of sheep / A.S. Carver // Biotechnology. 1993. – 11, 1263-1270.
32. Chang I.K.Germ line chimera produced by transfer of cultured chick primordial germ cells / I.K. Chang, A. Yoshiki, M. Kusakabe, A. Tajima, T.Chikamune, M. Naito, T. Ohno // Cell Biol Int.- 1995.- 19 (7), 569-576.
33. Chong H. Replication-competent retrovirus produced by a ‘split-function’ third generation amphotropic packaging cell line / H. Chong, R.G. Vile // Gene Ther. 1996. – 3, 624-629.
34. Clark A.J. Expression of human antihemophilic factor IX in the milk of transgenic sheep / A.J. Clark, P. Simons, I. Wilmut // Biotechnology 1989. – 7, 487-492.
35. Coffin J.M. Structure and classification of retroviruses. In ‘The
36. Retroviridae’ (ed. L.A. Levy ) / J.M Coffin // Plenum Press, NY, 1992. 19-49.
37. Cone R.D. High-efficiency gene transfer into mammalian cells: generation of helper-free recombinant retrovirus with broad mammalian host range / R.D. Cone, R.C. Mulligan // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1984.- 81, 6349-6353.
38. Cosset F.L. A new avian leukosis virus-based packaging cell line that uses two separate transcomplementing helper genomes // F.L. Cosset // J. Virol.t 1990.- 64, 1070-1078.
39. Cosset F.L. Packaging cells for avian leukosis virus-based vectors with various host ranges./ F.L. Cosset // J. Virol.- 1992.- 66, 5671-5676.
40. Das R.C. Production of therapeutic proteins from transgenic animals / R.C. Das // Bio Business.- 2001, 60-62.
41. Donahue R.E. Helper virus induced T-cell lymphomas in non-human promates after retroviral mediated gene transfer / R.E. Donahue, S.W. Kessler,
42. D.Bodine, K.Mc Donagh, C. Dunbar, S. Goodman, B. Agricola, E. Byrne, M.Raffeld, R. Moen, J. Bacher, K.M. Zsebo, A.W. Nienhuis // J. Exp. Med.- 1992.176, 1125-1135.
43. Emery D. W. Development of a condensed locus control region cassette and testing in retrovirus vectors for a gamma-globin / D.W. Emery // Blood Cells Mol Dis. 1998. -24,322-339.
44. Eyal-Giladi H. Avian primordial germ cells are of epiblastic origin / H.Eyal-Giladi, M. Ginsburg, A. Farbarov // J Embryol Exp Morphol.- 1981.- 65, 139-147.
45. Fraser R.A. Efficient incorporation of transfected blastodermal cells into chimeric chicken embryos / R.A. Fraser, R.S. Carsiense, M.E. Clark, R.I.Etches // Int. J. Dev. Biol.- 1993.- 37, 381-385.
46. Gilbert A.B. Egg albumen and its formation / A.B.Gilbert // Physiology and Biochemistry of the Domestic Fowl, Academic Press, 1984.- 1291-1329.
47. Gray D.A. Insertional mutagenesis: neoplasia arising from retroviral integration / D.A. Gray // Cancer Invest.- 1991.- 9, 295-304.
48. Grosovsky AJ. Insertional inactivation of the tk-locus in a human B lymphoblastoid cell line by a retroviral shuttle vector / A.J. Grosovsky, A.Skandalis, L. Hasegawa, B.N Walter // Mutat. Res.- 1993.- 289, 297-308.
49. Hammer R.E. Brinster Produktion of transgenic rabbits, sheer and pigs by microinjection / RE. Hammer, V.G. Pursel, C.E. Rexroad, R.I. Wall, D.I. Bolt, I.M. Ebert, RD. Palmiter, R.L. Brinster // Nature.- 1985.- 315, 680-683.
50. Harvey A.J. Consistent production of transgenic chickens using replication-deficient retroviral vectors and high-throughput screening procedures / A.J. Harvey, G. Speksnijder, L.R. Baugh, J.A. Morris, R. Ivarie // Poult Sci.-2002.- 81 (2), 202-212.
51. Harvey A.J. Expression of exogenous protein in the egg white of transgenic chickens / A.J. Harvey // Nat. Biotechnol.- 2002.- 20, 396-399
52. Henighausen L. // J. Cell. Biochem. 1992. – 49, 325-332.
53. Hu S. Generation of competent virus in the REV helper cell line C3. / S.Hu, J. Bruszewski, M. Nicolson, J. Tseng, R.Y. Hsu, R. Bosselman // Virology.-1987.- 159,446-449.
54. Ko J.H. Production of biologically active human granocyte colony stimulating factor in the milk of transgenic goat / J.H. Ko // Transgenic Reseach. -2000.-9,215-222.
55. Korhonen V.P. Expression of bovine beta-lactoglobulin human erythropoietin fusion protein in the milk of transgenic mice and rabbits / V.P.Korhonen, M. Tolvanen, J.M. Hyttinen // Eur. J. Biochem. 1997. – 15, 482489.
56. Krimpenfort P. Ceneration of transgenic dairy cattle using in vitro embryo production / P. Krimpenfort, A. Rademakers, W. Eyestone // Gamete Res. -1983.-8, 29-47.
57. Lampe D.J. Factors affecting transposition of the Himarl mariner transposon in vitro / D.J. Lampe// Genetics.- 1998.- 149,179-187
58. Larsson E. Human endogenous proviruses / E. Larsson, N. Kato, M.Cohen // Curr. Top. Microbiol, Immunol. 1989. – 148, 115-132.
59. Levy J.A. Isolation of lymphocytopathic retroviruses from San Francisco patients with AIDS / J.A. Levy, A.D. Hoffmann, S.M. Kramer, J.A.Landis, J.M. Shimabukuro, L.S. Oshiro // Science.- 1984.- 225, 840-842.
60. Li Y. Ballistic transfection of avian primordial germ cell in ovo / Y. Li, J. Behnam, K. Simkiss // Transgenic Res.- 1995.- 4 (1), 26-29.
61. Linial M. Transfer of defective avian tumor virus genomes by a Rous sarcoma virus RNA packaging mutant / M. Linial // J. Virol.- 1981.- 38, 380-382.
62. Linial M. An avian oncovirus mutant (SE21Qlb) deficient in genomic RNA: biological and biochemical characterization. / M. Linial, E. Medeiros, W.S.Hayward // Cell.- 1978.- 15,1371-1381.
63. Love J. Transgenic birds by DNA microinjection / J. Love, C. Gribbin, C. Mather, H. Sang // Biotechnology. 1994. – 12, 60-63.
64. Lower R. Identification of human endogenous retroviruses with complex mRNA expression and particle formation / R. Lower, K. Boiler, B.Hasenmaier, C. Korbmacher, N. Muller-Lantsch, J. Lower, R. Kurth // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. – 90, 4480-4484.
65. Mann R. Construction of a retrovirus packaging mutant and its use to produce helper-free defective retrovirus / R. Mann, R.C. Mulligan, D. Baltimore // Cell. 1983.- 33, 153-159.
66. Massoud M. The deleterious effects of human erythropoietin gene driven by the rabbit whey acidic protein gene promoter in transgenic rabbits / M.Massoud, J. Attal, D. Thepot // Reprod. Nutr. Dev. 1996. – 36, 555-563.
67. Miller A.D Retroviral packaging cells / A.D. Miller // Hum. Gene Ther. 1990.- 1,5-14.
68. Miller A.D. Redesign of retroviral packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production / A.D. Miller, C. Buttimore // Mol. and Cell. Biol. 1986. – 6, 2895-2902.
69. Miller A.D. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene / A.D. Miller, M.F. Law, I.M. Verma// Mol. Cell. Biol. 1985.-5, 431-437.
70. Miller D. Gene transfer by retrovirus vectors occurs only en cells that are actively replicating an the time of investion / D. Miller, M. Adam, V. Miller // Mol. Cel. Biol. 1990. – 10, 4239-4242.
71. Mozdziak P.E. Development of transgenic chickens expressing bacterial beta-galactosidase / P.E. Mozdziak, S. Borwornpinyo, D.W. McCoy, J.N. Petitte // Dev Dyn. 2003. – 226 (3), 439-445.
72. Naito M. Production of germline chimeric chickens, with high transmission rate of donor-derived gametes, produced by transfer of primordial germ cells / M. Naito, A. Tajima, Y. Yasuda, T. Kuwana // Mol Reprod Dev. -1994.- 39 (2), 153-161.
73. Naldini L. Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector /
74. Naldini, U. Blomer, F.H. Gage, D. Trono, I.M. Verma // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. – 93, 11382-11388.
75. Naldini L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector / L. Naldini, U. Blomer, P. Gallay, D. Ory, R. Mulligan, F.H. Gaga, I.M. Verma, D. Trono // Science. 1996. – 272, 263-267.
76. Nilson B.H.K. Targeting of retroviral vectors through protease-substrate interactions / B.H.K. Nilson //Gene Ther. 1996. – 3, 280-286.
77. Ory D.S. A stable human-derived packaging cell line for production of high retrovirus / vesicular stomatitis virus G pseudotypes / D.S. Ory, B.A.Neugeboren, R.C. Mulligan // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. – 93, 11400 -11406.
78. Pain B. Long-term in vitro culture and characterisation of avian embryonic stem cells with multiple morphogenetic potentialities. / B. Pain, M.E.Clark, M. Shen, H. Narazawa, M. Sakurai, R.I. Etches // Development. 1996. – 122, 2339-2348
79. Petitte J.N. The origin of the avian germ line and transgenesis in birds / J.N. Petitte, L. Karagenc, M. Ginsburg // Poult. Sci. 1997. – 76 (8), 1084-1092.
80. Petitte J.N. Production of somatic and germline chimeras in the chicken by transfer of early blastodermal cells / J.N. Petitte, M.E. Clark, G. Liu,
81. A.M.Verrinder Gibbins, R.I. Etches // Development. 1990. – 108, 185-189.
82. Poiesz B.J. Detection and isolation of type-C retrovirus particles from fresh and cultured lymphocytes of a patient with cutaneous T-cell lymphoma /
83. B.J.Poiesz, A.F. Ruscetti, P.A. Gazdar, P.A. Bunn, J.D. Minna, R.C. Gallo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. – 77, 7415-7419.
84. Rigg R.J. A novel human amphotropic packaging cell line: High titer, complement resistance, and improved safety / R.J. Rigg, J. Che n, J.S. Dando, S.P.Forestell, I. Plavec, E. Bohnlein // Virology. 1996. – 218, 290-295.
85. Roe T. Integration of murine leukemia virus DNA depengs on mitosis / T. Roe, T. Reynolds, P.O. Brovn // EMBO J. 1993. – 12, 2099-2108.
86. Russell S.J. Gene therapy: Science, medicine and the future / S J.Russell // Br. Med. J. 1997.-315, 803-815.
87. Salter D.W. Transgenic chickens: insertion of retroviral genes into the chicken germ line / D.W. Salter, E.J. Smith, S.H. Hughes, S.E. Wright, L.B.Crittenden // Virology. 1987.- 157(1), 236-240.
88. Salter D.W. Gene insertion into the chicken germ line by retroviruses / D.W. Salter, E.J. S mith, S.H. Hughe s, S.E. Wright, A.M. Fadly, R.L. Witter, L.B.Crittenden //Poult Sci. 1986. – 65(8), 1445-1458.
89. Salter D.W. Insertion of a disease resistance gene into the chicken germline / D.W. Salter, L.B. Crittenden // Biotechnology. 1991.- 16, 125-131.
90. Sang H. Transgenic chicken Metods and potential applications / H.Sang // Trends Biotechnol. – 1994. – 12, 451-420.
91. Seamon J.A. Inserting a nuclear targeting signal into a replication-competent Moloney murine leukemia virus affects viral export and is not sufficient for cell cycle-independent infection / J.A. Seamon // J. Virol. 2002. – 76(16), 8475-8484.
92. Shank P. Avian oncovirus mutant (SE21Qlb) deficient in genomic RNA: characterization of a deletion in the provirus / P. Shank, M. Linial // J. Virol.-1980.- 36, 450-456.
93. Sherman A. Transposition of the Drosophila element mariner into the chicken germ line / A. Sherman // Nat. Biotechnol. 1998. – 16, 1050-1053.
94. Temin H.M. Safety considerations in somatic gene therapy of human disease with retrovirus vectors / H.M. Temin // Hum. Gene Ther.- 1990. 1,111123.
95. Uckert W. Retrovirus-mediated gene transfer in cancer therapy / W.Uckert, W. Walther // Pharmac. Ther. 1996. – 63, 323-347.
96. Urven L.E. Distribution of extracellular matrix in the migratory pathway of avian primordial germ cells / L.E. Urven, U.K. Abbott, C.A. Erickson// Anat Rec. 1989. – 224(1), 14-21.
97. Velande W.H. Expression of human protein C in trancgenic swine / W.H. Velande // Harnessing biotechnology for the 21st century: Proc. 9th International Biotechnology Symposium and Exposition Virginia, August 16-21. -1997.-34-37.
98. Vick L. Transgenic birds from transformed primordial germ cells / L.Vick, Y. Li, K. Simkiss // Proc. R. Soc. Lond. 1993. – 251, 179-182.
99. Waddington D. Chronology of events in the first cell cycle of the polyspermic egg of the domestic fowl (Gallus domesticus ) / D. Waddington // Int. J. Dev. Biol. 1998.- 42, 625-628.
100. Watanabe S. Construction of a helper cell line for avian retikuloendotheliosis virus cloning vectors / S. Watanabe, H.M. Temin // Mol. Ceii. Biol. 1983. – 3, 2241-2249.
101. Way J.C. Transposition of plasmid-borne TnlO elements does not exhibit simple length-dependence / J.C. Way, N. Kleckner // Genetics. 1985.- Ill, 705-713.
102. Wall R.J. High level synthesis of a heterologous milk protein in the mammary glands of transgenic swine / R.J. Wall // Proc. Natl. Acad. Sci. 1991. -88, 1696-1700.
103. Weiss R. RNA tumor viruses / R. Weiss, N. Teich, H. Varmus, J.M.Coffin // Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1985.
104. Wentworth B.C. Manipulation of avian primordial germ cells and gonadal differentiation / B.C. Wentworth, H. Tsai, J.H. Hallett, D.S. Gonzales // Poultry Sci. 1989. – 68, 999-1010.
105. Wentworth B.C. Primordial germ cell for genetic modification of poultry / B.C. Wentworth, H. Tsai, A. Wentworth, E. Wong, J. Proudman, M.Halawani // In: Beltsville Symposia in Agricultural Research: Biotechnology’s
106. Role in Genetic Improvements of Farm Animals American Society of Animal Science, Savoy, Illinois, 1996. 202-227.
107. Wilmut I., Archibald A., McClenaghan M. // Experientia. 1991. -47, 905-912.
108. Wright G. High level expression of active human a-1-antitrypsin in the milk of transgenic sheep / G. Wright, A. Carver, D. Cottom // Biotechnology. -1991.-8, 830-834.
109. Yasuda Y. A method to obtain avian germ-line chimaeras using isolated primordial germ cells / Y. Yasuda, A. Tajima, T. Fujimoto, T. Kuwana // J. Reprod Fertil. 1992. – 96(2), 521-528.
