Лабораторная диагностика аутоиммунных заболеваний печени – Eurolab

Кишкун А.А.
ЛАБОРАТОРНАЯ МЕДИЦИНА №9/2008

Аутоиммунные механизмы играют важную роль в патогенезе ряда заболеваний печени. Важным признаком нарушения иммунитета при хронических активных заболеваниях печени является появление в крови аутоантител, реагирующих с различными антигенными компонентами клеток и тканей. Обзор литературы посвящен лабораторной диагностике аутоиммунных заболеваний печени, включая хронический аутоиммунный гепатит, первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит и аутоиммунный холангит. Представлена информация о диагностических тестах, разработанных для подтверждения аутоиммунного характера поражения печени (антимитохондриальные антитела, антитела к гладким мышцам, антитела к печеночно-специфическому липопротеину и мембранным антигенам печени, антитела к микросомальному антигену печени и почек, антитела к нейтрофилам и др. ), предложены основные методы выявления антител при аутоиммунных заболеваниях печени, алгоритм диагностики симптоматических и бессимптомных заболеваний печени. Отмечается, что понимание данных особенностей выявления аутоантител позволит врачу наилучшим образом использовать полученные результаты для диагностики заболевания и оценки эффективности лечения у каждого конкретного пациента.

Аутоиммунными принято считать те заболевания, в основе которых лежит иммунная реакция на собственные (аутологичные) антигены тканей и органов. Находящиеся в норме в небольшом количестве естественные аутоантитела, обычно IgM-класса, не вызывают патологических процессов, а стимулируют регенерацию тканей. Для иммунной аутоагрессии необходимо не только увеличение их количества, но и качественные изменения – усиление антигенной специфичности, повышение авидности и т.д.
Критерии аутоиммунных болезней были сформулированы в 1961 году L.Witebsky и включают наличие аутоантител или сенсибилизированных лимфоцитов во всех случаях заболевания, или хотя бы на некоторых его стадиях.
Аутоиммунные механизмы играют важную роль в патогенезе целого ряда заболеваний печени: хронического активного гепатита, хронического аутоиммуного гепатита, первичного билиарного цирроза печени, первичного склерозирующего холангита, аутоиммунного холангита.

Важным признаком нарушенного иммунного статуса при хроническом активном заболевании печени является наличие в крови аутоантител, реагирующих с различными антигенными компонентами клеток и тканей. Аутоиммунный хронический гепатит (вариант хронического активного гепатита) представляет собой гетерогенную группу прогрессирующих воспалительных заболеваний печени. Синдром аутоиммунного хронического гепатита характеризуется клиническими признаками гепатита продолжительностью более 6 месяцев и гистологическими изменениями, включающими молекулярный некроз и портальную инфильтрацию.

Аутоиммунный хронический гепатит характеризуется следующими признаками

У пациентов с хроническим аутоиммунным гепатитом начальное поражение печени пока неизвестной этиологии включает аутоиммунный механизм в качестве основного вследствие генетически обусловленного дефекта Т-супрессоров против собственных печеночно-специфических липопротеинов и антигенов мембран гепатоцитов. Стимуляция Т-клеток приводит к активации В-клеток, что приводит к выработке антител против мембранного антигена. Эти антитела связываются с поверхностью гепатоцитов и создают условия для развития антителозависимого цитолиза, опосредованного Т-киллерами.

Аутоиммунные заболевания печени включают первичный билиарный цирроз (ПБЦ), который проявляется как бессимптомный хронический деструктивный непеченочный холангит, за которым следует стадия холестаза, заканчивающаяся циррозом. Если раньше ПБЦ считался редким заболеванием, то сейчас его распространенность стала весьма значительной. Увеличение числа случаев диагностики ПБЦ связано с внедрением в клиническую практику современных лабораторных методов. Наиболее характерным для ПБЦ является повышение уровня щелочной фосфатазы, обычно более чем в 3 раза (у некоторых пациентов он может быть в пределах нормы или слегка повышен), ГГТП, ЛАП, 5-нуклеотидазы (отражает синдром холестаза). Уровень щелочной фосфатазы не имеет прогностического значения, но снижение ее уровня отражает положительный ответ на лечение. Активность АСТ и АЛТ умеренно повышена (активность трансаминаз в 5-6 раз выше нормы не характерна для ПБЦ).

Первичный склерозирующий холангит (ПСХ) – хроническое холестатическое заболевание печени неизвестной этиологии, характеризующееся негнойным деструктивным воспалением, облитерирующим склерозом и сегментарной дилатацией внутри- и внепеченочных желчных протоков, приводящее к развитию билиарного цирроза печени, портальной гипертензии и печеночной недостаточности. Концепция ПСХ как аутоиммунного заболевания с генетической предрасположенностью основывается на выявлении семейных случаев ПХС, сочетании ПХС с другими аутоиммунными заболеваниями (наиболее часто с неспецифическим язвенным колитом), нарушениях в клеточном и гуморальном иммунитете, выявлении аутоантител (антинуклеарных, к гладкой мускулатуре, цитоплазме нейтрофилов). Для ПХС характерен стабильный синдром холестаза (обычно не менее чем дву-кратное повышение уровня щелочной фосфатазы), уровень трансаминаз в крови повышен у 90% больных (не более чем в 5 раз).
Аутоиммунный холангит – хроническое холестатическое заболевание печени, обусловленное иммуносупрессией. Гистологическая картина ткани печени при данном заболевании практически аналогична первичному билиарному циррозу печени, а спектр антител включаетповышенные титры антинуклеарных и антимитохондриальных антител.

Аутоиммунный холангит, по-видимому, не является вариантом первичного мошоночного холангита

Лабораторные тесты для диагностики аутоиммунных заболеваний печени
Впервые концепция аутоиммунных повреждений печени была подтверждена выявлением в сыворотке крови больных антиядерных антител (антинуклеарного фактора). Эти антитела выявляют в 50–70% случаев активного хронического (аутоиммунного) гепатита и в 40–45% случаев ПБЦ. Наличие антинуклеарных антител (АНА) у больных с хроническим аутоиммунным гепатитом – один из основных показателей, позволяющих отличить это заболевание от затянувшегося вирусного гепатита. Вместе с тем, в низких титрах антиядерные антитела могут встречаться у практически здоровых людей и их титр увеличивается с возрастом. Они могут появляться после приема некоторых лекарств, таких как прокаинамид, метилдофа, отдельные противотуберкулезные и психотропные препараты. Очень часто титр антиядерных антител увеливается у здоровых женщин при беременности.
В дальнейшем для потверждения аутоиммунного характера повреждений печени и проведения дифференциальной диагностики различных форм аутоиммунного гепатита и ПБЦ были разработаны диагностические тесты, позволяющие определять антимитохондриальные антитела, антитела к гладкой мускулатуре, антитела к печеночно-специфическому липопротеину и антигенам мембраны печени, антитела к микросомальному антигену печени и почек, антитела к нейтрофилам и др.
Основным методом выявления антител при аутоиммунных заболеваниях печени является метод непрямой иммунофлуоресценции (НИФ). Методика проведения исследования заключается в том, что на срезы тканей, содержащие соответствующие антигены, наносят сыворотку крови больного, в которой могут содержаться антитела к этому антигену. После отмывания несвязавшихся белков наносят меченую флуоресцин-изоцианатом антисыворотку против человеческого γ-глобулина. При наличии в сыворотке больного антител к соответствующему тканевому антигену выявляется специфическое свечение.

Недостатком метода непрямой иммунофлуоресценции является субъективность способа оценки результата анализа. В связи с этим за последние годы разработаны Тест-системы для иммуноферментного анализа (ИФА), в которых соответствующие антигены нанесены на специальный сорбент. Метод ИФА позволяет количество выражать результаты исследований. Антимитохондриальные антитела (АМА) вырабатываются к антигену внутренней мембраны митохондрий.
Антиген по структуре представляет собой липопротеин, участвующий в транспортных функциях мембраны. Имеющиеся в арсенале лабораторий диагностические тестсистемы позволяют определять как суммарные АМА, так и их отдельные подтипы. Антимитохондриальные антитела методом НИФ в сыворотке в норме не определяются; при использовании метода ИФА нормальные значения – менее 20 МЕ/мл, 20–25 МЕ/мл – пограничные значения. Повышенный титр суммарных АМА (1:160 и выше) характерен для ПБЦ (более чем у 90% больных).

Очень небольшая часть больных ПБЦ оказывается АМА-отрицательной. При вторичном билиарном циррозе АМА выявляются в низких титрах или чаще совсем не определяются. Низкие титры АМА могут также наблюдаться при хроническом активном гепатите, хроническом аутоиммунном гепатите (до 20% случаев), алкогольном или вирусном гепатите.
В настоящее время выделяют 4 подтипа АМА. Для ПБЦ специфичными считаются антитела к антигену митохондрий М-2 (представляет собой комплекс ферментов на внутренней мембране митохондрий). Наличие антител против М-2 антигена можно выявить тест-системами ИФА. Диагностическая чувствительность тест-систем в отношении выявления ПБЦ составляет 98%, специфичность – 96%. Это означает, что только 5% больных с ПБЦ не имеют в крови АМА М-2. Повышенным считается уровень АМА М-2 более 25 МЕ/мл.
Наряду с антителами анти-М2 при ПБЦ встречаются, в большинстве случаев одновременно, антитела анти-М9, анти-М4 и анти-М8, которые реагируют с различными эпиотипами мембраны митохондрий. Существует связь между профилем АМА и прогнозом ПБЦ. Изолированное обнаружение в сыворотке крови анти-М9 и/или анти-М2 коррелирует с хорошим прогнозом ПБЦ. Прогрессирующее течение заболевания отмечается у больных с анти-М2, анти-М4 и/или анти-М8, в сочетании с повышенным уровнем билирубина. Это означает, что с помощью профиля АМА можно идентифицировать неактивные (ранние) и активные (прогрессирующие) формы ПБЦ и соответственно выделять группы больных с низким и высоким риском.

Антитела к гладкой мускулатуре (АГМ) представляют собой антитела к белку актину или неактиновым компонентам (тубулину, виментину, десмелину и скелетину) и появляются в ответ на повреждение гепатоцитов. Они относятся к IgG или IgM при наличии холестаза. АГМ обнаруживают методом непрямой иммунофлуоресценции. Субстратом для непрямой иммунофлуоресценции обычно служит ткань, содержащая гладкие мышцы человеческого или животного происхождения (гладкомышечный слой слизистой оболочки желудка крысы, гладкомышечный слой внешней оболочки желудка крысы, гладкомышечные элементы клубочков почки крысы, гладкомышечный слой сосудов почки крысы). АГМ выявляют в 60–80% случаев аутоиммунного (липоидного) гепатита (в титре 1:80 и выше), в 50% случаев ПБЦ и не обнаруживают при СКВ и внепеченочных поражениях желчных путей. АГМ присутсвуют у 70% больных с хроническим активным гепатитом и относятся к классу IgG. АГМ обнаруживаются при остром вирусном гепатите и исчезают при выздоровлении. В ряде случаев АГМ могут быть обнаружены в низких титрах при инфекционном мононуклеозе, цитомегаловирусной инфекции, микоплазменной пневмонии, лимфопролиферативных заболеваниях, наркомании, злокачественных новообразованиях, у женщин, страдающих бесплодием и иногда у здоровых людей. У этих групп больных АГМ относятся к классу IgМ.
Антитела к печеночно-специфическому липопротеину (анти-LSP) определяются методом непрямой иммунофлуоресценции. LSP-антиген представляет собой гетерогенный материал из мембран гепатоцитов, содержащий 7–8 антигенных детерминант, некоторые из них печеночно-специфичны, другие неспецифичны. Именно антитела к LSP вызывают аутоиммунную реакцию с развитием антителозависимого цитолиза гепатоцитов и провоцируют рецидив при отмене глюкокортикостероидов у больных хроническим аутоиммунным гепатитом. Наличие анти-LSP в сыворотке крови является отличительным признаком аутоиммунного гепатита и лишь в 5% случаев выявляется среди больных HBs4позитивным хроническим активным гепатитом. Однако в большом числе клинических наблюдений показано, что анти-LSP выявляются и при хронических заболеваниях печени вирусной этиологии (в 48–97 % случаев). Антитела к микросомальному антигену печени и почек (LKM) представляют собой гетерогенную группу аутоантител, которая на основании их антигенов-мишеней делится на три подтипа. Компонент цитохрома Р4450IID6 с молекулярной массой 50 000 был идентифицирован как главный антиген для LKM первого типа (LKM-1), LKM-2 направлены к цитохрому Р4450IIС9 и обнаруживались у пациетов принимавших ticrynafen (диуретик тиениловой кислоты, в настоящее время не применяется), LKM-3 были выявлены в сыворотке крови больных хроническим вирусным гепатитом D (обнаруживаются у 5–13% больных), но антиген до сих пор не идентифицирован. Они могут встречаться у пациентов с аутоиммунным гепатитом II типа (у 10% больных). Уровень антител к микросомальному антигену печени и почек в сыворотке в норме – менее 20 МЕ/мл, 20–25 МЕ/мл – пограничные значения.
В основе определения уровня антител к микросомам печени и почек (LKM-1) лежит метод ИФА. Это исследование является дополнением к уже существующим методам диагностики аутоиммунного гепатита.
Антитела к цитоплазме нейтрофилов (АНЦА) – комплекс антител, специфичных к различным гранулоцитарным, моноцитарным и, возможно, эндотелиальным цитоплазматическим антигенам. При определении АНЦА методом непрямой иммунофлуоресценции с использованием нейтрофилов здоровых доноров, могут наблюдаться два различных типа флуоресценции – классический диффузный (к-АНЦА) и перинуклеарный (п-АНЦА). Эти типы флуоресценции обусловлены различной антигенной направленностью АНЦА. Антитела при классической диффузной флуоресценции в большинстве случаев направлены против протеинкиназы-3 и усиливающего бактерицидное действие белка нейтрофилов. Обнаружение к-АНЦА в сыворотке крови высокоспецифичный признак для гранулематоза Вегенера.
П-АНЦА направлены против широкого спектра цитоплазматических антигенов: миелопероксидаза, эластаза, лактоферрин, катепсин G и другие полипептиды. Наиболее часто п-АНЦА выявляют при первичном склерозирующем холангите (у 60–85% больных), неспецифическом язвенном колите (у 60–75%), хроническом аутоиммунном активном гепатите (у 60–70%), первичном билиарном циррозе (у 30–40%), болезни Крона (у 10–20% больных). У больных первичным склерозирующим холангитом присутствие п4АНЦА не коррелирует с клинической активностью поражения печени.

Классификация аутоиммунного гепатита и критерии диагностики
В настоящее время в клинической практике используется субклассификация аутоиммунного гепатита, которая в соответствии с серологическим профилем предусматривает выделение 4 типов аутоиммунного гепатита (табл. 1).

Таблица 1
Профиль антител при аутоиммунном гепатите

• Первый тип аутоиммунного гепатита характеризуется наличием антинуклеарных антител (у 70-80% пациентов) и антител к гладким мышцам (у 50-70% пациентов), часто связанных с цитоплазматическими антинейтрофильными антителами. Хотя АМА является чувствительным и специфическим маркером ПБЦ, он может быть обнаружен у 15% пациентов с клиническими и гистологическими признаками аутоиммунного гепатита, в том числе в случаях клинического улучшения в ответ на иммуносупрессивную терапию. Считается, что у этих пациентов наблюдается “синдром наложения” аутоиммунного гепатита и ПБЦ. Титр AMA в этой подгруппе аутоиммунного гепатита редко превышает 1:40. Антигенная специфичность этих АМА сходна с той, которая наблюдается при классическом ПБЦ (М-2 АМА). В этих случаях биопсия проводится повторно, а за пациентом ведется последующее наблюдение. Титр антител против рецептора асиалогликопротеина (ASGP-R), гликопротеина в плазматической мембране гепатоцитов, коррелирует с активностью аутоиммунного гепатита I типа. Действительно, тканевая экспрессия ASGP-R наиболее выражена в перипортальной зоне, где часто наблюдается поэтапный некроз, отражающий активность заболевания.
• Второй тип аутоиммунного гепатита, характеризующийся наличием антител к микросомам печени и почек (у 100% пациентов), делится на две подгруппы (подтипы 2a и 2b). Пациенты второго типа обычно отрицательны по ANA и MGA, но часто имеют антитела против микросомальной фракции щитовидной железы, тиреоглобулина и париетальных клеток. Подтип 2a выявляется у молодых женщин с высокими титрами анти-LKM-1 (основной диагностический маркер этого подтипа) и антител к цитозольному антигену печени (анти-LC-1), отрицательной серологией на гепатит C и активным заболеванием, реагирующим на лечение кортикостероидами. Подтип 2b встречается у пожилых пациентов, и “предпочтение” женщин менее выражено. У этих пациентов низкие титры LKM-1, клинические проявления заболевания менее выражены, часто обнаруживаются антитела к вирусу гепатита С (анти-HCV); подтип 2b менее отзывчив на иммуносупрессивную терапию, чем подтип 2a. Наличие анти-HCV у пациентов с хроническим аутоиммунным гепатитом 2 типа является ложноположительным, и существует корреляция между частотой ложноположительных анти-HCV и концентрацией гамма-глобулина у этих пациентов. Чем выше концентрация гамма-глобулина в сыворотке крови, тем чаще встречаются ложноположительные результаты на анти-HCV. В этих случаях необходимо определить РНК ВГС в сыворотке крови или лимфоцитах (методом ПЦР). Некоторые авторы сообщают, что около 3% пациентов с вирусным гепатитом С могут иметь антитела против микросом печени и почек, но их титр значительно ниже, чем у пациентов с хроническим аутоиммунным гепатитом 2 типа. У пациентов с гепатитом второго типа уровень IgA в сыворотке крови ниже, чем у пациентов с заболеванием первого типа. Несколько исследований показывают, что аутоиммунный гепатит второго типа сопровождается развитием цирроза печени чаще, чем гепатит первого типа.
• Третий подтип аутоиммунного гепатита выделяется на основании обнаружения в сыворотке крови антител против растворимых антигенов печени (анти-SLA), которые, как недавно было показано, идентичны гепато-панкреатическому антигену (LP). Анти-SLA/LP связываются с цитокератинами печени 8 и 18. Эти антитела вырабатываются только при аутоиммунном гепатите и служат важным серологическим маркером аутоиммунного гепатита (они имеют специфичность 100% и являются единственными антителами, обнаруживаемыми у 15% пациентов с аутоиммунным гепатитом). В настоящее время разработаны тест-системы для выявления анти-SLA/LP, которые доступны в качестве рутинных лабораторных тестов.
• Высокие титры АМФ, направленных против F-актина, характеризуют четвертый подтип аутоиммунного гепатита, который часто встречается у детей.

Следует отметить, что различие между 4 типами хронического аутоиммунного гепатита имеет малое клиническое значение с точки зрения тактики лечения, поскольку большинство пациентов, независимо от типа, хорошо реагируют на иммуносупрессивную терапию.

Диагноз хронического аутоиммунного гепатита считается уверенным, если

• Титры антинуклеарных антител, антител к гладким мышцам, антител к печеночному и почечному микросомальному антигену в титрах более 1:80;
• Концентрация IgG в сыворотке крови более чем в 1,5 раза выше верхней границы нормы;
• Отсутствие в анамнезе гепатотоксических препаратов или злоупотребления алкоголем;
• Отсутствие РНК ВГС в сыворотке крови пациента

Для более точного диагноза аутоиммунного гепатита можно использовать оценку всех показателей в баллах (табл. 2).

Таблица 2
Диагностические критерии аутоиммунного гепатита

Итоговая оценка будет проведена следующим образом

• При общем количестве баллов более 15 до лечения и более 17 после лечения, аутоиммунный гепатит можно считать установленным;
• При общем количестве баллов 10-15 до лечения и 12-17 после лечения, аутоиммунный гепатит возможен (не может быть исключен);
• При более низком общем количестве баллов, аутоиммунный гепатит можно исключить.

Методологические особенности оценки результатов аутоиммунных тестов
При оценке результатов аутоиммунных тестов необходимо понимать, что аутоантитела представляют собой иммуноглобулины классов IgM, IgА и IgМ, специфически связывающиеся с антигенными эпитопами молекул клеток и тканей человеческого организма. Эти аутоантитела, реагирующие с клеточными антигенами, появляются в крови в результате нормального функционирования иммунной системы и могут быть обнаружены в сыворотке практически всех здоровых людей любого возраста. Вместе с тем, аутоантитела выявляются при многих заболеваниях и патологических состояниях, хронических интоксикациях (алкоголизм); они могут быть транзиторно индуцированы инфекционным процессом, опухолью, либо приемом лекарственных препаратов. Встречаемость многих аутоантител возрастает с возрастом.

Однако благодаря высокой встречаемости некоторых аутоантител при определенных патологических процессах в печени, они могут служить специфическими лабораторными маркерами аутоиммунных заболеваний.
Определенный спектр аутоантител при определенных аутоиммунных заболеваниях указывает на особенности функционирования иммунной системы и отражает ее особую предрасположенность к формированию аутоиммунных ответов.
Продукция аутоантител не является постоянной величиной. Встречаемость аутоантител может нарастать с увеличением длительности аутоиммунного заболевания печени. Аутоантитела синтезируются в составе нормального пула иммуноглобулинов сыворотки крови плазматическими клетками. Каждая разновидность аутоантител, даже направленная к одному к одному антигену, представляет собой поликлональную популяцию аутоантител, представленную молекулами иммуноглобулинов с различными физико-химическими свойствами (поликлональные антитела реагируют с разными эпитопами на поверхности антигена). В идеале лабораторные методы должны выявлять не одну разновидность молекул (аутоантител), а целый спектр аутоантител, направленных к разным эпитопам антигена.
В настоящее время не существует абсолютно корректного подхода (референтного метода) для выявления аутоантител при аутоиммунных заболеваниях. Основные причины этого состоят в следующем:

• Большинство методов основаны на связывании аутоантител и целевого антигена, поэтому результат метода зависит от концентрации аутоантител в сыворотке крови, а также от сродства аутоантител и антигена;
• При многих аутоиммунных заболеваниях уровень аутоантител может быть низким или избирательно теряться (например, при поражении почек) с мочой, что приводит к ложноотрицательным результатам;
• Или наоборот, высокая концентрация низкоаффинных аутоантител при небольшом количестве высокоаффинных антител в крови может привести к ложноположительной реакции;
• Повышение уровня аутоантител может быть спровоцировано воспалением, инфекцией, раком или приемом ряда лекарств;
• Чтобы отличить преходящую индукцию от хронического присутствия аутоантител при аутоиммунных заболеваниях, необходимо определять аутоантитела через 6 месяцев (период полураспада аутоантител 3 месяца);
• Перекрестное взаимодействие аутоантител – часто возникает при нескольких аутоиммунных заболеваниях, поэтому при оценке результатов теста необходимо использовать так называемую “пограничную” или “серую” зону, когда реакция не является ни положительной, ни отрицательной;
• В качестве антигена в большинстве тест-систем используются антигены из тканей животных – это еще одна возможная причина неправильных результатов;
• Для ранней диагностики аутоиммунных заболеваний необходимо использовать тест-системы с высокой чувствительностью, отрицательный результат в. ..

Таким образом, диагностика аутоиммунных заболеваний печени является достаточно сложной задачей. Понимание указанных особенностей выявления аутоантител позволит врачу наилучшим образом использовать полученные результаты для диагностики заболевания и оценки эффективности лечения у каждого конкретного пациента.