Классификация продуктов биотехнологии. — киберпедия
I. В зависимости от количества.
1. Продукты тонкого биологического синтеза – от 100 кг до 1000 т в год – вакцины, витамины, антибиотики для медицины. основная стоимость связана с очисткой и анализом.
2. Продукты маломасштабного биосинтеза – до 20 тыс. тонн в год – аминокислоты для пищевой промышленности, напитки, продукты получаемые ферментацией, антибиотики для с/х.
3. Крупномасштабный биологический синтез – сточные воды после биологической очистки, биополимеры для отдельных отраслей промышленности – полисахариды для извлечения остатков нефти, выщелачивания Ме из руд. Основное условие – дешевизна. Более 20 тыс. тонн в год.
II. По товарным формам.
1. Биопрепараты – основной компонент – жизнеспособные клетки м/о или др. организмы закваски, бактериальные удобрения.
2. Инактивированная биомасса м/о – белок одноклеточных организмов.
3. Биопрепараты на основе очищенных метаболитов – ферменты, витамины, гормоны, антибиотики.
III. Образование биотехнологических продуктов в зависимости от стадии роста биологических объектов.
1. Первичные метаболиты.
2. Вторичные метаболиты.
Биотехнология наиболее развита в Японии (аминокислоты), США (1-я крупная биотехнологическая компания). В XXI в. ок. 20% продуктов станут продукцией биотехнологии. В РБ биотехнология отнесена к новым высоким технологиям. Это связано с ограниченностью ресурсов, никой энерго- и материалоемкостью биотехнологических производств. Возможностью использования местного сырья, экологичность биотехнологических проектов на фоне радиационного и химического загрязнения.
Основные потребители биотехнологической продукции:
Сельское хозяйство (ветеринария);
Пищевая промышленность;
Химическая промышленность.
Для развития ветеринарии требуется ок. 500 препаратов, ок. 100 получат методами биотехнологии.
Схема биотехнологического производства
Исходное сырье культивирование конечный продукт постеферментативная стадия
↑ (ферментация) (целевой) (конечному продукту придается товарный вид,
(предферментация) ↓ утилизируются отходы производства)
(подогрев, размельчение аппаратура биологические объекты сырья и др.).
Характеристика биологических объектов биотехнологии
Клетки м/о – прокариоты и одноклеточные эукариоты (дрожжи, простейшие, водоросли);
Высшие растения;
Животные;
Вирусы;
Трансгены;
Многокомпонентные системы, представленные клетками или определенными компонентами клеток.
Источники получения биологических объектов:
Коллекции культур;
Образцы природного материала. В этом случае необходимо получить чистую культуру м/о.
Существует 5 стадий биотехнологического производства.
Две начальные стадии включают подготовку сырья и биологически действующего начала. В процессах инженерной энзимологии они обычно состоят из приготовления раствора субстрата с заданными свойствами (рН, температура, концентрация) и подготовки партии ферментного препарата данного типа, ферментного или иммобилизованного. При осуществлении микробиологического синтеза необходимы стадии приготовления питательной среды и поддержания чистой культуры, которая могла бы постоянно или по мере необходимости использоваться в процессе. Поддержание чистой культуры штамма-продуцента – главная задача любого микробиологического производства, поскольку высокоактивный, не претерпевший нежелательных изменений штамм может служить гарантией получения целевого продукта с заданными свойствами.
Третья стадия – стадия ферментации, на которой происходит образование целевого продукта. На этой стадии идет микробиологическое превращение компонентов питательной среды сначала в биомассу, затем, если это необходимо, в целевой метаболит.
На четвертом этапе из культуральной жидкости выделяют и очищают целевые продукты. Для промышленных микробиологических процессов характерно, как правило, образование очень разбавленных растворов и суспензий, содержащих, помимо целевого, большое количество других веществ. При этом приходится разделять смеси веществ очень близкой природы, находящихся в растворе в сравнимых концентрациях, весьма лабильных, легко подвергающихся термической деструкции.
Заключительная стадия биотехнологического производства – приготовление товарных форм продуктов. Общим свойством большинства продуктов микробиологического синтеза является их недостаточная стойкость к хранению, поскольку они склонны к разложению и в таком виде представляют прекрасную среду для развития посторонней микрофлоры. Это заставляет технологов принимать специальные меры для повышения сохранности препаратов промышленной биотехнологии. Кроме того, препараты для медицинских целей требуют специальных решений на стадии расфасовки и укупорки, так должны быть стерильными. Далее приводится характеристики каждой из стадий промышленного микробиологического синтеза.
3Объекты, методы и продукты биотехнологии, их характеристика, цели применения в пищевой отрасли
4.Особенности хранения и культивирования промышленных штаммов продуцентов.
БАЗА БИОТЕХНОЛОГИИ
Биотехнологическое производство должно иметь продуцент, сырье для приготовления питательных сред, оборудование для всех этапов технологического процесса. Типичный элементарный состав микроорганизмов следующий: (в % к весу сухой биомассы) углерод – 50%, азот – 7-12% и микроэлементы. Все клетки содержат также кислород и водород. Среда для выращивания микроорганизмов должна включать элементы, которые входят в состав клеток, и сохранять правильное их соотношение.
Выбор состава питательных сред
Применяемые в промышленности продуценты чаще всего являются хемогетеротрофами. Их потребности в энергии и углероде удовлетворяются простыми сахарами – полупродуктами, например, свеклосахарной или кукурузной мелассой, которая содержит 50 – 70% ферментируемых сахаров, сыворотку, отходы консервной промышленности или неочищенными сахара. Для получения дрожжей используют сульфатно-спиртовую барду – побочный продукт бумажного производства.
Промышленные питательные среды для обеспечения разнообразных типов метаболизма микроорганизмов должны соответствовать определенным требованиям.
Прежде всего, они должны содержать все элементы, необходимые для построения клетки: макроэлементы (углерод, азот, фосфор, железо, кислород, кальций, сера, калий, магний) и микроэлементы (марганец, молибден, цинк, медь, кобальт, никель, ванадий, хлор, натрий, кремний и др.). Эти элементы должны находится в удобоусвояемых конкретным микроорганизмом соединениях. В качестве источника углерода могут быть использованы разнообразные органические соединения: углеводы, многоатомные спирты, органические кислоты, аминокислоты, белки и др. Источником азота служат аммонийные соединения, аминокислоты, пептиды, белки. Остальные макроэлементы содержатся в неорганических соединениях – солях фосфорной и других кислотах. В питательную среду микроэлементы поступают с органическими субстратами, солями и водой. Факторы роста, в частности, витамины (особенно группы В), вносят в среду в виде чистых веществ или в составе органических субстратов.
Одно из условий качественной питательной среды – влажность не менее 20%.
Концентрация солей в среде должна соответствовать концентрации солей в микробной клетке, то есть обеспечивать изотонию. Для большинства микроорганизмов концентрация солей должна быть 0,5%. Галофильные микроорганизмы,обитающие в средах с высокими концентрациями солей, живут при концентрации солей до 3%.
Окислительно-восстановительный потенциал – мера способности химического вещества присоединять электроны, восстанавливаться (Eh среды) – должен соответствовать потребностям микроорганизма. Рост анаэробных бактерий в стандартной среде подавляется при величинах Eh выше 100 мВ, некоторые виды не растут при Eh выше 330 мВ. Аэробные, микроаэрофильные и факультативно-анаэробные виды имеют оптимальное для себя значение Eh, снижение или превышение его ингибирует их рост. В ограниченных пределах микробы способны изменять Eh в сторону оптимального для них значения. Для создания нужной для роста микроба Eh среду аэрируют или из нее удаляют кислород. Снизить окислительно-восстановительный потенциал можно добавлением восстановителей (0,5% глюкозы, 0,05% натрия тиогликолата, 0,025% цистеина, 0,1% аскорбиновой к-ты).
Концентрация водородных ионов (pH) среды должна быть оптимальной для выращиваемого микроорганизма (оптимальный диапазон pH 4,5 – 8,5).
Питательная среда должна быть стерильной.
В производстве фармацевтической продукции применяются натуральные, полусинтетические и синтетические питательные среды. Сырьем для натуральных средслужат животные ткани, микроорганизмы, растения, овощи, фрукты, зерно и другие продукты, а также отходы производства. К плюсам использования натуральных сред относится наличие всего комплекса необходимых компонентов, к минусам – малая пригодность для крупнотоннажных производств из-за непостоянства состава. Комплексные натуральные среды, состоящие из пшеничных отрубей и биошрота, широко используются для получения ферментов. Естественные среды, представляющие собой экстракты растительного и животного материала (виноградный сок, молоко, пептон, сыворотку), долгое время были единственными для культивации микроорганизмов и клеток тканей. Подобные среды удобны, так как содержат все источники, необходимые для роста и размножения, имеют неопределенное содержание макро- и микроэлементов.
Полусинтетические среды состоят из соединений известной химической природы и комплекса неопределенных веществ. Это меласса, кукурузный экстракт, отруби, жидкие парафины, древесные гидролизаты и другие отходы пищевых и непищевых производств (антибиотики, аминокислоты, дрожжи, ферменты).
Синтетические среды состоят из химически чистых, строго дозированных веществ, служащих для культивирования микроорганизмов и простейших в лабораторных условиях. Среди таких веществ – соединения известной химической природы: этанола, метанола, природного газа и метана.
6 Принципы выбора сырья и составления питательных сред в биотехнологии.
Питательные среды могут иметь неопределенный состав, то есть включать биогенные добавки – мясной экстракт, кукурузную муку, морские водоросли и т.д. Применяют также среды, приготовленные из чистых химических соединений в заранее определенных соотношениях – синтетические среды. Среды обоих типов имеют как преимущества, так и недостатки. С экономической точки зрения наиболее целесообразно употребление более дешевого природного сырья. Применение синтетических сред строго определенного состава позволяет регулировать протекающие в биореакторе процессы, добиваться их оптимизации. Компромиссным подходом является использование полусинтетических сред, в состав которых вместе с соединениями известной химической природы входят биогенные добавки.
Компонентный состав сред зависит от пищевых потребностей микроорганизмов. Конструктивные и энергетические процессы у микроорганизмов крайне разнообразны, поэтому столь же разнообразны их потребности в питательных веществах. Например, автотрофные организмы синтезируют органические вещества клеток из СО2 и Н2О с утилизацией энергии света (фотоавтотрофы) или химических реакций окисления (хемоавтотрофы), поэтому питательные среды для таких микроорганизмов могут не содержать органические соединения. Очень простые по составу среды для культивирования цианобактерий: источником энергии служит свет, углерода – СО2, азота – N2.
Однако во многих биотехнологических производствах используются микроорганизмы, требующие органических источников углерода и энергии (гетеротрофы). Так как микроорганизмы способны ассимилировать любые органические соединения, то потенциальными ресурсами для биотехнологии могут служить все мировые запасы органических веществ. При выборе сырья необходимо учитывать его влияние на себестоимость готового продукта, доступность, методы получения, свойства и качественные характеристики.
Потребности микроорганизмов в тех или иных соединениях определяются особенностями данного вида. В самом приближенном виде физиологические потребности микроорганизмов в питательных веществах можно выявить, определив химический состав микробной клетки. Среда для выращивания микроорганизмов должна включать элементы, которые входят в состав клеток, и сохранять правильные соотношения этих элементов.
В состав практически любой питательной среды входят такие компоненты, как вода, соединения углерода, азота, фосфора и других минеральных веществ, витамины.
Вода.Вода должна отвечать требованиям ГОСТ (чистая, бесцветная, без привкуса, запаха и осадка).
Источники углерода.Легкодоступными считаются сахара: глюкоза, сахароза, лактоза, за ними следуют многоатомные спирты: глицерин, маннит и др. Далее следуют полисахариды: целлюлоза, гемицеллюлоза, крахмал, которые могут стать источниками углерода либо после превращения их в усвояемые микроорганизмами моно- и низкомолекулярные олигосахариды, либо если микроорганизмы имеют набор ферментов, гидролизующих эти вещества. Такими микроорганизмами являются плесневые грибы родов Aspergillus, Penicilli-um, бактерии рода Bacillus и др.
На практике встречается большое количество микроорганизмов, которые успешно утилизируют органические кислоты, особенно в анаэробных условиях.
Низкомолекулярные спирты – метанол и этанол – относятся к числу перспективных видов сырья. Многие дрожжи родов Candida, Hansenula и др. способны ассимилировать этанол. Дрожжи родов Pichia, Candida и др., бактерии рода Flavobacterium используют в качестве единственного источника углерода метанол.
Некоторые виды микроорганизмов (незначительная часть) используют в качестве источника углерода и энергии углеводороды: н-алканы и некоторые фракции нефти.
Источники азота. Азот может содержаться в форме неорганических солей или кислот. Большинство дрожжей хорошо усваивает аммиачные соли, а также аммиак из водного раствора, потребность в нитратах испытывают только некоторые виды дрожжей. Источником азота могут служить и органические соединения: аминокислоты, мочевина и т.д., которые легко усваиваются микроорганизмами.
Известно, что бактерии более требовательны к источникам азота, чем другие микроорганизмы (грибы, актиномицеты и дрожжи).
Источники фосфора.Фосфор является важнейшим компонентом клетки. Он входит в состав АТФ (аденозинтрифосфата), АДФ, АМФ и тем самым обеспечивает нормальное течение энергетического обмена в клетке, а также синтез белков, нуклеиновых кислот и другие процессы биосинтеза. Фосфор вносят в среду в виде солей фосфорной кислоты.
Источники витаминов и микроэлементов.Потребность микроорганизмов в витаминах и микроэлементах различна, тем не менее практически все микроорганизмы лучше растут в присутствии витаминов. Эффективной добавкой к питательным средам оказался кукурузный экстракт благодаря наличию в нем витаминов, аминокислот и минеральных элементов в легко ассимилируемых формах. В рецептуры сред включают также дрожжевой автолизат, дрожжевой экстракт, сок картофеля, молочную сыворотку, экстракт солодовых ростков и другие продукты. Микроэлементы в состав питательных сред вводят в микродозах, в противном случае они оказывают ингибирующее действие на микробные клетки.
Состав питательной среды для конкретного вида микроорганизма устанавливается экспериментально. Задача специалиста, оптимизирующего состав среды, – выбрать из перечня источников углерода, азота, фосфора и других веществ наиболее оправданные в экономическом и экологическом отношении и внести их в необходимом соотношении.
Питательная среда — однокомпонентный или многокомпонентный субстрат, применяемый для культивирования микроорганизмов или культур клетоквысших организмов.
9. Мутационная изменчивость. Это естественный фактор эволюции. В популяции клеток в каждом поколении по каждому гену обнаруживается 105 – 107 мутантных клеток. Благодаря спонтанным мутациям микроорганизмы легко приспосабливаются к новым условиям существования. Частота мутаций возрастает после действия мутагенных факторов. Индуцированные мутации позволяют получить биообъект с высокими полезными продуктивными свойствами.
Так, мутанты некоторых прототрофов становятся способными к синтезу необычных продуктов. Так, если Streptomyces grisius синтезирует хлортетрациклин, то мутант полученный на его основе – тетрациклин.
Мутационные изменения приводят к физиологическим и морфологическим изменениям клетки. Поэтому у мутанта становятся иными требования к питательной среде и к условиям культивирования. У суперпродуцентов положительные мутанты встречаются реже, т.к. их геном уже насыщен мутациями.
Отбор положительных мутантов. Для этого проверяют тысячи мутантных культур, используют скрининговые методы или естественный отбор. Например, хересные винные дрожжи (Saccharomyces oviformis), при переокислении спирта образуют продукты, которые придают вину хересный букет. Но такие дрожжи чувствительны к концентрациям спирта выше 15%. Так, при длительном повышении содержания спирта до 18% и пользуясь методом естественного отбора, удалось выделить штамм, который образует херес при повышенных концентрациях спирта.
Положительные мутанты можно выделять успешнее, если знать особенности их метаболизма. При этом можно увеличить частоту получения положительных мутантов путем использования химических или биохимических факторов: селективная детоксикация питательного субстрата; добавление в питательную среду ингибитора целевого продукта; увеличение проницаемости клеточной мембраны; усиление выведения продукта из клетки; использование ауксотрофных мутантов; применение катаболитной репрессии; перевод ферментов из категории индуцируемых в разряд конституционных и т.д.
Так, при селективной детоксикации питательного субстрата токсические вещества взаимодействуют с продуктом сверхсинтеза. В результате детоксицируется субстрат и сохраняется выживаемость мутанта. Так получают бета-лактамные антибиотики, которые комплексируются с ионами тяжелых металлов или с токсическими аналогами аминоксилот.
Гибридизация микроорганизмов. Ранее этот метод селекции применялся редко, так как для микроорганизмов не свойственно скрещивание (половое размножение). Например, при гибридизации грибов используют вегетативную гибридизацию, которая аналогична половому процессу размножения. При этом генетический материал двух вегетативных клеток грибов обменивается при клеточном слиянии (парасексуальный цикл). Этот процесс можно оптимизировать методами клеточной инженерии.
Другой вид гибридизации – слияние протопластов. Протопласты – это клетки, лишенные клеточной стенки. Ее можно удалить следующими способами: выращивание клеток в присутствии антибиотиков, которые препятствуют образованию клеточной стенки; действие ферментом лизоцимом или комплексом ферментов микробного генеза (“дрожжелитин”).
Слиянию протопластов способствуют некоторые стимуляторы (полиэтиленгликоль). В гибридах затем легко образуется нормальная клеточная стенка.
Гибридизация микроорганизмов позволяет:
· интегрировать в одной клетке нужные свойства двух и более штаммов или видов. Так, дрожжи штамма Saccharomyces serevisiaе были скрещены с пивными дрожжами вида Saccharomyces carllsbergensis. Полученный гибрид полностью гидролизовал раффинозу до моносахаридов. Это не было характерно для родительских видов дрожжей;
· отбирать рекомбинанты второго поколения, т.е. после рекомбинации хромосом. При этом появляются клетки с новыми свойствами. Так, пивные дрожжи, сбраживающие сахарозу и мальтозу скрестили с дикими штаммами дрожжей, которые не сбраживали оба дисахарида. Получили гибрид, который не сбраживал сахарозу, но ассимилировал мальтозу. Такие клоны гибридов применяют при изготовлении “бархатного” пива (с несброженной сахарозой) и кваса;
· ввести в геном микроорганизма мутации других штаммов. Это сокращает длительность ступенчатого отбора. Так был получен штамм E. coliдля производства треонина;
· инокулировать в бактерию гены, которые не характерны для данного вида или увеличить число уже существующих генов. Это повышает продуктивность микроорганизма по данному гену. Например, в E. coli были введены гены, определяющие синтез амилазы, целлюлазы, сахаразы и т.д.
16 Методы стерилизации питательных сред. Термическая непрерывная и периодическая стерилизация питательных сред
Стерилизация питательных сред.
Стерилизация является заключительной операцией при приготовлении любой питательной среды. Питательные среды после разливки их в сосуды чаще стерилизуют нагреванием — термостерилизацией. Перед стерилизацией сосуды (колбы, пробирки) с налитыми в них средами закрывают ватными пробкам предохраняющими их в дальнейшем от заражения микробами из вне.
Стерилизация насыщенным паром под давлением. Такую стерилизацию проводят в автоклаве. Автоклав представляет собой двухстенный металлически котел, герметично закрывающийся крышкой. Между стенками котла находится вода. Стерилизуемые объекты ставят на дно автоклава. Автоклав снабжен манометром указывающим давление пара в котле, выпускным краном для выхода воздуха и пара и предохранительным клапаном, обеспечивающим выход пара при превышении заданного давления.
Автоклав обогревается газом или электричеством. Образующийся при кипении воды пар поступает в котел через отверстия, имеющиеся в верхней части его внутренней стенки, и через выпускной края выходит, вытесняя из автоклава воздух. После полного вытеснения воздуха (при этом выделяется сильная сплошная струя пара) выпускной кран закрывают и в автоклаве постепенно повышается давление. Когда оно достигнет 1 атм (по манометру), подогрев регулируют, чтобы поддерживать давление на одном уровне в течение необходимого времени. При таком давлении водяной пар имеет температуру 120° С.
При этой температуре выдерживают питательные среды (если объем их не более 0,5—1 л) в течение 20—30 мин. При таком режиме стерилизации погибают не только вегетативные клетки микроорганизмов, споры плесеней и дрожжей, но и бактериальные споры. По окончании стерилизации выключают источник нагрева, после того как стрелка манометра снизится до нуля, осторожно открывают выпускной кран, чтобы вытеснить из автоклава пар. Крышку автоклава открывают лишь после того, как он охладится.
Стерилизуют в автоклаве воду, мясо-пептонный бульон, дрожжевой автолизат, агаровые и другие среды, которые не претерпевают заметных изменений при темпетуре 120° С.
Стерилизация текучим паром. Эта стерилизация бывает дробной, или последовательной. Она применяется чаще для питательных сред, которые могут заметно изменять свои свойства при стерилизации в автоклаве, например молоко, среды, содержащие сахара, желатин.
Для стерилизации используется аппарат Коха (кипятильник Коха). Он представляет собой металлический цилиндр, покрытый изоляционным материалом, с двойным дном и неплотно закрывающейся крышкой, снабженной термометром. На дно цилиндра наливается вода. Над водой располагается металлическая подставка с отверстиями для прохождения пара, на которую помещают стерилизуемые питательные среды.
Вода в аппарате нагревается газом или электричеством до 100°С. Образующийся пар (текучий), прогревает стерилизуемые материалы, выходит через специальное отверстие и неплотности крышки.
Стерилизация производится дробно — в три приема три дня подряд по 30 мин ежедневно. Повторная стерилизация, вызывается тем, что при температуре 100° гибнут не все споры бактерий. В промежутках между нагревами (каждый — раз в сутки) питательная среда выдерживается в термостате при 25° С. За это время оставшиеся живыми споры прорастают в вегетативные клетки, которые и уничтожаются последующим нагревом при 100° С.
Холодная стерилизация (фильтрация). Метод холодной стерилизации применяется для жидких сред, которые не выдерживают нагревания.
Способ заключается в фильтровании сред через специальные мелкопористые бактериологические фильтры, задерживающие микроорганизмы (ультромикробы проходят).
Фильтры изготовляются из различных материалов из фарфоровой глины, асбеста, нитроклетчатки (мембранные ультрафильтры) и др.
17 Важным технологическим процессом в биологических производствах является очистка от механических включений и стерилизация воздуха, используемого для вентиляции цехов и боксов, передачи под давлением стерильных культуральных жидкостей и растворов, поддержания избыточного давления в стерильных емкостях. В значительных количествах стерильный воздух используют для аэрации процесса культивирования. Отводимый из лабораторных и производственных помещений отработанный воздух также подвергается очистке от присутствующих в нем микроорганизмов и контролируется на чистоту.
Основным требованием к техническим системам очистки и стерилизации воздуха является очистка его от микрофлоры и других примесей. Кроме обеспечения этого требования, рассматриваемые системы должны обеспечивать получение воздуха с определенными термодинамическими характеристиками (температура, влажность, давление), от которых, в конечном счете, зависит эффективность работы систем в целом (рис. 1)
Рисунок 1 – Типовая технологическая схема очистки стерилизации воздуха в биотехнологии.
Технологическая схема очистки и стерилизации воздуха осуществляется по следующим стадиям: предварительная (грубая) очистка от механических примесей, сжатие, охлаждение, отделение сконденсированных паров, влаги и масла (при поршневых компрессорах) и собственно стерилизация.
· 1-й этап – грубая очистка. На входе заборника воздуха или другого газа устанавливают, в зависимости от расхода, висциновый фильтр или фильтр Рекка, которые очищают газ от грубых примесей перед компрессором.
· 2-й этап – сжатие газа. В настоящее время в различных отраслях промышленности в основном используются поршневые компрессоры (например, марок ТК-350/5, ТК-300/840, ТКК-1/4 и ТЭ и др.).
Однако более рациональным является применение турбовоздуходувок (например, марки 920-33), что позволяет упростить и улучшить схему газоподготовки. При сжатии воздух нагревается от 100 до 200 °С, поэтому его необходимо охладить до температуры культивирования.
Из-за высокого влагосодержания атмосферного воздуха при охлаждении выпадает 50 – 70 % исходной влаги, которая может увлажнить фильтрующий материал, поэтому воздух после компрессора охлаждают до 25 – 30 °С в охладителе 3, а после отделения влаги во влагоотделителе 4 нагревают в теплообменнике 5 до температуры культивирования в стерильной сушилке между головным и индивидуальным фильтрами или путем подачи пара в рубашку фильтров, если она предусмотрена.
· 3-й этап – первичная очистка и фильтрация газа. После подогревателя газ поступает в первую ступень очистки и фильтрации – головной фильтр.
· 4-й этап – тонкая очистка и фильтрация газа. После головного фильтра газ поступает в индивидуальный фильтр и далее в биореактор.
При использовании турбовоздуходувок схема фильтрации упрощается за счет исключения из нее холодильника и брызгомаслоотделителя.
Для обеспечения эффективности использования нагретого воздуха, следует:
1. Часть воздуха после второй ступени компрессора охладить до температуры ниже точки росы и после влагоотделения в брызгоуловителе поднять его температуру путем смешения с горячим воздухом, отобранным после компрессора (перед воздухоохладителем) до заданного предела.
Предусмотреть для автоматического поддержания температуры на заданном уровне регулятор температуры в комплекте с пневматическим клапаном, установленным на линии подачи горячего сжатого воздуха.
· 3. Учесть, что вариант подогрева воздуха путем его смешения с горячим воздухом можно применить на тех предприятиях, где расстояние от компрессора до головного фильтра не слишком велико (ориентировочно около 100 м). При условии же большей удаленности здания компрессорного цеха от головных фильтров следует производить подогрев воздуха специальным паровым подогревателем, расположенным в непосредственной близости от головного фильтра.
· 4. Учесть, что в зимний период, когда влагосодержание воздуха незначительно, нет необходимости в применении дополнительного подогрева воздуха и система подогрева можно отключить. Режим охлаждения воздуха в воздухоохладителях следует отрегулировать таким образом, чтобы температура его перед индивидуальным фильтром составляла 45 – 50 °С.
Необходимо отметить, что только при соблюдении всех перечисленных выше условий может быть гарантирована эффективная работа системы фильтрации воздуха.
8. Селекция продуцентов БАВ.
Неотъемлемым компонентом в процессе создания наиболее ценных и активных продуцентов, т.е. при подборе объектов в биотехнологии, является их селекция.
Выделение м/о из естественных мест обитания предполагаемого продуцента отбирают образцы материала (берут пробы материала) и производят посев в селективную среду, т.е. получают накопительные культуры. Следующим этапом является выделение чистой культуры с дальнейшим изучением изолированного микроорганизма. Главным путем селекции является сознательное конструирование геномов на каждом этапе отбора нужного продуцента.
В развитии микробных технологий сыграли важную роль методы, базирующиеся на селекции спонтанно возникающих измененных вариантов, характеризующихся нужными полезными признаками. При таких методах обычно используется ступенчатая селекция: на каждом этапе отбора из популяции микроорганизмов отбираются наиболее активные варианты (спонтанные мутанты), из которых на следующем этапе отбирают новые, более эффективные штаммы.
Процесс селекции наиболее эффективных продуцентов значительно ускоряется при использовании метода индуцированного мутагенеза. В качестве мутагенных воздействий применяются УФ, рентгеновское и гамма-излучения, определенные химические вещества. Однако и этот прием также не лишен недостатков, главным из которых является его трудоемкость и отсутствие сведений о характере изменений.
Применение перечисленных подходов в сочетании с приемами классической селекции является сутью современной селекции микроорганизмов-продуцентов.
10. Типовые схемы получения основных продуктов микробного синтеза.
Антибиотики — один из первых продуктов микробиологического синтеза, которые широко производят для медицины и сельского хозяйства. Большинство антибиотиков накапливается вне клеток микроорганизма-продуцента, которыми в основном являются Актиномицеты, некоторые грибы и бактерии, главным образом их мутантные формы. Антибиотические препараты, употребляемые преимущественно в медицине, отличаются высокой степенью чистоты. На корм животным чаще идёт концентрат среды после выращивания в ней продуцента, иногда вместе с биомассой, содержащий значительное количество др. продуктов обмена веществ продуцента, в том числе витамины, аминокислоты, нуклеотиды и т.п. Некоторые антибиотики (фитобактериомицин, трихотецин, полимиксин) используются как средства защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов.
Витамины, провитамины, коферменты. Методом микробиологического синтеза производят в основном витамин B12, а частично и витамин B2 и его коферментную форму — флавинадениндинуклеотид (ФАД), каротиноиды, эргостерин. Кроме того, развивается производство разных др. соединений этого типа (никотинамидные коферменты и др.). Витамин B12 получают практически только путём микробиологического синтеза. Основными продуцентами при этом служат пропионовокислые бактерии, актиномицеты, а также комплекс метанобразующих бактерий, использующих отходы бродильной промышленности (послеспиртовые, ацетоно-бутиловые барды и др.) и применяемых в основном для получения кормового концентрата (высушенная среда с биомассой продуцента). Многие микроорганизмы способны к сверхсинтезу витамина B2 с активным выделением его в среду, но в качестве промышленных продуцентов употребляют наиболее активные культуры, главным образом грибы Eremothecium ashbyii и Ashbya gossipii. Помимо свободного витамина, при помощи Е. ashbyii получают также ФАД. в-каротин — провитамин витамина А, получаемый также другими способами (извлечение из моркови и др. объектов, химический синтез), образуется наряду с другими каротиноидами многими микроорганизмами и содержится в клетках, придавая биомассе характерную окраску от жёлтой до красных тонов; однако наибольший практический интерес представляет культура Blakeslea trispora — самый активный синтетик, которым и пользуются в основном в качестве продуцента при промышленном биосинтезе. Эргостерин — провитамин витамина D2 — содержится в клетках многих дрожжей; основным источником его промышленного получения служат пекарские дрожжи. Однако уже имеются дрожжевые культуры со значительно более высоким уровнем накопления эргостерина. Комплекс витаминов и коферментов синтезируется, кроме того, в процессе развития дрожжей и накапливается в дрожжевой биомассе, которая привлекает всё более пристальное внимание как источник этих соединений.
Ферменты, синтезируемые микроорганизмами, и создаваемые на их основе ферментные препараты приобрели большое значение в народном хозяйстве, особенно в пищевой промышленности. Продуцентами ферментов — протеаз, амилаз, фосфатаз, целлюлаз, пектиназ, глюкозооксидазы, липаз, каталазы — служат многие мицелиальные грибы, некоторые актиномицеты и бактерии. В зависимости от локализации фермента подвергают обработке микробную массу или фильтрат, свободный от микробных клеток. Получение чистых ферментных препаратов связано со значительными технологическими трудностями. Такие препараты обычно очень дороги; поэтому в промышленности используют комплексные препараты, содержащие, например, протеазы и липазы, протеазы и амилазы.
Аминокислоты. Наблюдаемый во многих странах недостаток ряда аминокислот в рационах человека и кормах животных вызвал промышленное их получение, в том числе и методом микробиологического синтеза. Существенное преимущество микробиологического синтеза аминокислот перед химическим методом заключается в получении их непосредственно в виде природных изомеров (L-формы). Из аминокислот наиболее важны Лизин и Глутаминовая кислота. Продуцентами аминокислот обычно служат культуры бактерий, относящихся к родам Brevibacterium и Micrococcus; для производства используются преимущественно мутанты-ауксотрофы, осуществляющие сверхсинтез соответствующей аминокислоты с выделением её в среду.
Нуклеотиды. Широкое развитие микробиологического синтеза нуклеотидов, в частности инозиновой, гуаниловой и др. кислот, получил в Японии, где они используются главным образом как добавки к специфическим продуктам восточной кухни. В будущем нуклеотиды приобретут, вероятно, более важное значение в качестве регуляторов многих энзиматических и гормональных процессов в животном организме. Накопление нуклеотидов происходит преимущественно в культуральной жидкости, т. е. вне клеток продуцентов. Для нуклеотидов, как и аминокислот, используются биохимические мутанты с выраженным сверхсинтезом нужного соединения.
Белок и белково-витаминные препараты. Особое значение как источник белка имеет микробная биомасса. Производство такой биомассы на дешёвом сырье рассматривают как одно из средств устранения растущего белкового дефицита в питании человека и животных. Наи<</div>
§
Животные клетки используются для культивирования вирусов, при производстве вакцин, для получения интерферона и т.д.
Суспензию отдельных клеток получают обработкой размельченной ткани эмбриона пищеварительным ферментом трипсином. Если клеткам в такой суспензии дать осесть на плоскую поверхность в сосуде с питательной средой, то клетки становятся плоскими и делятся, образуя монослой. В обычной методике культивирования пользуются цилиндрическими бутылями, которые медленно вращаются вокруг своей длинной оси. Рост клеток и выход биомассы можно увеличить, добавив к суспензии носитель – микроскопические гранулы из инертного синтетического полимера, на которых клетки закрепляются. Деление клеток млекопитающих происходит примерно раз в сутки (для сравнения – клетки дрожжей делятся каждые 1,5-2 ч, а бактериальные клетки – каждые 20-60 мин). Клетки млекопитающих нуждаются в многочисленных питательных веществах, поэтому в питательную среду следует добавлять смесь аминокислот, пуринов и пиримидинов для синтеза белков и нуклеиновых кислот, глюкозу в качестве источника углерода и энергии, витамины и минеральные соли для поддержания необходимого осмотического давления и значения рН, близкого к 7,2. Среда также должна содержать небольшие концентрации антибиотиков для подавления роста бактерий и 5-20 % сыворотки (из крови человека или из плода крупного рогатого скота). Для оптимального роста температуру культуры необходимо поддерживать около 37 ºС, так как ниже 36 ºС клетки либо делятся крайне медленно, либо не делятся вовсе; при температуре выше 38 ºС погибают. Большинство культур клеток млекопитающих, в том числе и клеток человека, удается сохранять неопределенно долгое время замороженными в специальной среде при – 180 ºС.
Чтобы показать способность клеток животных расти и делиться в культуре, потребовалось овладеть рядом подходов и методик. Особенности их приведены ниже.
1. Методики получения клеток, свободных от экзогенных прокариотов и грибов.
2. Методики разработки среды, в которых рост «вырезанных из ткани» или изолированных клеток не подавляется.
3. Методики наблюдения за клетками в динамике их развития.
4. Методики непрерывного культивирования культур клеток животных in vitro и поддержания их свободными от других биологических агентов.
Научную основу для разработки этих методик составляет представление о клетке как основном структурном элементе живых организмов животного и растительного происхождения. Идея о том, что клетки тканей животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro возникла на базе концепции, принадлежащей Клоду Бернару. Он предположил, что не только живые организмы способны сохранять постоянство внутренних условий, вне зависимости от изменений в окружающей среде. Клетка вне организма животного тоже будет стремиться поддерживать свои внутренние условия. Если различия между внутренними и внешними условиями будут незначительными, то высока вероятность роста и деления клетки. Такое понимание явления приводит к необходимости разработки сред, способных поддерживать и стимулировать рост клеток вне организма.
Массовое культивирование организмов для биотехнологических целей достаточно хорошо разработано применительно к бактериям, дрожжам и мицелиальным грибам, и лишь сравнительно недавно начались интенсивные исследования в области выращивания культур клеток животных и растений.
Потенциально очень важные органические соединения синтезируются только растительными или животными клетками, что заставляет изыскивать подходы в решении возникающих проблем, не обращая существенного внимания на стоимость этих технологий.
Клетки животных способны расти либо в виде суспензий, либо прикрепленными к плотному субстрату (твердой поверхности). Такие клетки как, HeLa (клетки, происходящие из опухоли человека) могут расти в любом из этих состояний; лимфобластомные клетки растут в суспендированных культурах; а нормальные диплоидные клетки способны расти только будучи прикрепленными к твердой поверхности. Монослойное культивирование животных клеток во многом определяется доступностью поверхности для их прикрепления, вследствие чего многие конструкторские разработки направлены на создание методов увеличении возможной площади прикрепления. Ранние технологии основывались преимущественно на использовании вращающихся пробирок или флаконов с целью лучшего обеспечения растущих клеток питательными веществами и воздухом.
Создаваемые в последнее время системы предназначаются для поддержания роста клеток на свернутых в виде “бухт” проницаемых для газов тефлоновых трубочках, каждая из которых имеет поверхность около 10 000 см (а общее их число в реакторе более 20). В таких условиях многие типы клеток культивируются довольно хорошо. Еще одним перспективным способом культивирования клеток животных является способ, основанный на использовании небольших бусин (шариков, микроносителей), к которым прикрепляются клетки. Шарики могут изготавливаться из сефадекса и обладать поверхностью в 7 см на 1 мг. Шарики способны плавать в суспендированном состоянии и на них могут расти клетки различных типов. Таким путем уже получают человеческий интерферон. Данный способ, полагают, способен заменить метод монослойных культур.
В 1922 году В. Роббинс и Котте независимо друг от друга показали возможность культивирования на синтетических питательных средах клеток меристемы корня томатов и кукурузы. Эти опыты положили начало применению метода культивирования изолированных клеток и органов растений. В 30-60-е годы ХХ века благодаря работам большого числа ученых (Ф. Уайт, Р. Готре и других) число видов растений, клетки и ткани которых выращивали in vitro, превысило 150.
Были описаны составы питательных сред, определены потребности культур в витаминах и стимуляторах роста, разработаны методы получения и выращивания больших масс клеточных суспензий, а также культивирования отдельной, выделенной из суспензии клетки. С использованием изолированных протопластов были разработаны методы гибридизации соматических клеток путем слияния протопластов с помощью полиэтиленгликоля и введения в них вирусных РНК, клеточных органелл, клеток бактерий. С помощью метода культуры меристем были получены безвирусные экономически важные растения с высоким коэффициентом размножения.
В настоящее время активно продолжается разработка методов глубинного культивирования клеток, слияния изолированных протопластов и т. д. Такие исследования привели к появлению более продуктивных и приспособленных к условиям культивирования клеточных штаммов, используемых для создания новых форм и сортов сельскохозяйственных, лекарственных, декоративных и других растений.
11.1. Методы создания клеточных культур растений
Основным типом культивируемой растительной клетки является каллусная. Каллусная клетка, в результате деления которой возникает каллусная ткань, представляет один из типов клеточной дифференцировки, присущей высшему растению. Для растения каллус является тканью, возникающей при исключительных обстоятельствах (обычно при травмах) и функционирующей непродолжительное время. Эта ткань защищает травмированное место, накапливает питательные вещества для анатомической регенерации или генерации утраченного органа. Значительно реже культивируют клетки опухолей растений различного происхождения. Культуры опухолевых клеток независимо от способа культивирования на уровне морфологии мало отличаются от культур каллусных клеток. Важным физиологическим отличием между ними является гормононезависимость опухолевых клеток, позволяющая им делиться и расти на питательных средах без добавок фитогормонов или их аналогов. Однако опухолевые клетки лишены способности давать начало нормально организованным структурам.
Для получения культивируемых каллусных клеток in vitro фрагменты тканей разных органов высших растений (экспланты) помещают на искусственную питательную среду в пробирки, колбы, чашки Петри. Процесс получения первичного каллуса и поддержание пересадочной культуры требует строго стерильных условий. Клетки специализированных тканей, эксплантированных на питательную среду, должны дедифференцироваться, то есть потерять структуры, характерные для их специфической функции в растении, и вернуться к состоянию делящейся клетки. Часто эксплант, используемый для получения каллуса, включает ткани, клетки которых различно дифференцированы.
В готовящейся к делению клетке стимулируется синтез всех типов РНК, исчезают тканеспецифические белки-антигены и появляются белки, специфичные для делящихся клеток и каллусной ткани. Это свидетельствует об изменении активности генов и белкового аппарата клеток при де- дифференцировке.
Образование каллуса не во всех случаях связано с травматическим воздействием. Каллус может возникнуть в результате пролиферации внутренних тканей экспланта без связи с поверхностью среза. Растущий каллус разрывает слои ткани и развивается на поверхности. Первичный каллус, возникший на эксплантах через 4-6 недель (в зависимости от скорости роста клеток), переносится на свежую питательную среду (субкультивируется). Различно дифференцированные клетки (в том числе и меристематические) переходят in vitro к сложному процессу дедифференциации, теряют присущую им структурную организацию и специфические функции и индуцируются к делению, образуя первичный каллус. В процессе субкультивирования формируется штамм, характеризующийся индивидуальными генетическими и физиологическими особенностями.
Основными компонентами питательных сред для культуры клеток и тканей растений являются минеральные соли (макро- и микроэлементы), источник углеродного питания (обычно сахароза или глюкоза), витамины, регуляторы роста. Иногда в состав питательных сред включают комплексные органические добавки (гидролизат казеина или смесь аминокислот, дрожжевой экстракт, экстракты из разных органов растений).
11.2. Методы выращивания культуры каллусных тканей
11.2.1. Поверхностное культивирование
Культура каллусных тканей выращивается поверхностным способом на полужидкой агаризованной среде (концентрация агара – 0,6-1 %), среде с применением других желирующих полимеров либо на мостиках из фильтровальной бумаги или дисках из пенополиуретана, погруженных в жидкую питательную среду. Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенной анатомической структуры. Цвет массы может быть белым, желтоватым, зеленым или красным; пигментированным полностью или зонально. Как правило, в длительной пересадочной культуре каллусные ткани теряют пигментацию и становятся более рыхлыми. Каллусные клетки, выращиваемые поверхностным способом, часто применяют для сохранения в растущем состоянии коллекций разных штаммов, линий, мутантов, для регенерации растений, из них также получают суспензии клеток, культивируемых в жидкой питательной среде.
11.2.2. Суспензионное культивирование
Культуры клеток растений, выращиваемые в жидкой питательной среде, обычно называют суспензионными (глубинными) культурами. Существуют определенные проблемы получения культуры, состоящей преимущественно из отдельных клеток или небольших их агрегатов. Для решения этих проблем используют методы получения клеточной суспензии применительно к растительным клеткам.
Выращивание клеточных суспензий в жидкой питательной среде имеет ряд преимуществ перед выращиванием каллусных клеток поверхностным способом. Суспензионные культуры удобнее для проведения биохимических и молекулярно-биологических экспериментов – изучения индукции ферментов и связи их с событиями клеточного цикла, экспрессии и репрессии определенных генов, изолирования и характеристик мутантов.
Суспензионную культуру можно получить из фрагментов органа растения (диски паренхимы и др.), хотя этот путь более трудоемкий и требует большего времени. Клетки экспланта должны при этом образовывать первичный каллус, и только после этого поверхностные каллусные клетки, попавшие в жидкую среду и размножившиеся в ней, дадут начало линии, способной расти в суспензии. Обычно для получения культуры клеток используется культура каллусной ткани. Для получения культуры клеток берется наиболее жизнеспособная (пролиферирующая) часть каллусной ткани, а ее количество в расчете на единицу объема питательной среды должно быть в 15-20 раз больше, чем при серийном культивировании на агаре. При этом может использоваться питательная среда того же состава, что и для поверхностного культивирования.
Образование первичной суспензии растительных клеток может быть результатом трех процессов:
– распада каллусной ткани на клетки и небольшие клеточные агрегаты в момент внесения в жидкую питательную среду;
– отделения клеток и клеточных агрегатов с поверхности кусочков ткани в течение первых субкультивирований;
– деления и роста клеток и распада разрастающихся клеточных агрегатов на более мелкие агрегаты и клетки.
Первичную суспензию перед субкультивированием разделяют на фракции по скорости седиментации, используя специальный цилиндр (берут верхнюю фракцию), либо фильтруют через 1-2 слоя марли, нейлоновые или металлические сита, чтобы избавиться от крупных плотных кусков каллусной ткани, остатков экспланта и очень крупных агрегатов.
Для глубинного культивирования растительных клеток применяют методы, разработанные для микробиологических целей. Используют закрытые или открытые системы в периодическом или проточном режимах. Однако при глубинном выращивании растительных клеток принцип турбидостата практически не применяется. Одной из причин этого является разрушения части клеток при отводе их к оптическому прибору. Выращивание суспензии клеток растений в установках непрерывного культивирования по принципу хемостата применяется как для изучения метаболизма клеток, стабильно поддерживающихся в разных фазах клеточного цикла, так и при промышленном выращивании клеточной биомассы с целью получения экономически важных продуктов.
Наиболее изученным и распространенным режимом глубинного культивирования клеточных суспензий в настоящее время является закрытая периодическая система. В этом случае для аэрации и перемешивания суспензии используют роллеры, качалки (обычно круговые), ферментеры с механическими и магнитными мешалками или ферментеры барботажного типа, где аэрация и перемешивание осуществляется воздушным потоком. Критериями роста в цикле выращивания служит увеличение числа клеток, их сырой и сухой массы. Модельная ростовая кривая имеет типичную S-образную форму, на которой различают: I – лаг-фазу; II – экспоненциальную фазу; III – фазу линейного роста; IV -замедленного роста; V – стационарную фаза; VI – фазу отмирания (рис. 11).
Рис. 11. Кривая роста клеточных суспензий в закрытой периодической системе
В латентной фазе (лаг-фазе) видимого роста инокулята не наблюдается. При этом наблюдается высокая интенсивность дыхания, максимальные значения энергетического уровня, интенсивный синтез ДНК, РНК, белков и других компонентов клетки, но низкий митотический уровень. Длительность фазы зависит от количества и физиологического состояния инокулята и условий культивирования. Экспоненциальная фаза характеризуется максимальными скоростью роста и величинами митотической активности, а также преобладанием мелких клеток меристематического типа. На протяжении линейной фазы скорость роста постоянна. Фаза замедленного роста связана с субстратным лимитированием и ингибированием продуктами обмена. Для стационарной фазы характерна малая скорость деградации клеток, которая уравновешивается делением клеток. В фазе отмирания клеток удельная скорость роста принимает отрицательное значение.
Форма реальных ростовых кривых может значительно отличаться продолжительностью фаз от модельной. Процессы ростового цикла зависят от вида растения, количества внесенного материала и условий культивирования (состав питательной среды, температура, начальное значение рН, состав газовой фазы, скорость перемешивания). Первичный и вторичный метаболизм культивируемых клеток растений видоспецифичен, зависит от типа дифференцировки исходных клеток растения и регулируется условиями выращивания. Генетическая изменчивость клеток как следствие их культивирования вне организма приводит к возникновению из первичной каллусной ткани генетически и фенотипически различающихся линий клеток. Это позволяет отобрать или экспериментально создать линии, сохраняющие биосинтетические системы, характерные для исходного растения, и линии, синтезирующие принципиально новые вещества.
11.3. Культивирование отдельных клеток
Источником отдельных клеток являются клеточные суспензии в жидкой питательной среде, мацерация (мацерация – размягчаю; разъединение клеток в результате растворения межклеточного вещества) тканей растений, изолированные протопласты после восстановления ими клеточной стенки. Причем изолированные протопласты являются идеальными отдельными клетками.
Культивирование отдельных клеток позволяет получать клоны и исследовать генетическую и физиологическую стабильность или изменчивость при выращивании клонового материала. Отдельные клетки важны для клоновой селекции мутантных, гибридных, трансформированных линий. Обычно в эти клетки вводят маркерные гены или создают маркерные признаки для обеспечения селективных условий отбора.
Мацерированные клетки ткани растения являются хорошей моделью для сравнительного изучения физиологических процессов в ткани и отдельной клетке. Вместе с тем при культивировании этих клеток на среде, стимулирующей деление клеток, они дифференцируются и образуют колонии каллусных клеток. Для получения отдельных мацерированных клеток используют специальные мацерирующие ферментативные препараты.
Отдельные клетки также могут быть получены из суспензий с использованием микроманипулятора, проточного цитофлуюориметра или путем последовательных разбавлений.
Индукция делений отдельных клеток возможна при применении очень богатой питательной среды, причем объем среды должен быть минимальным. Однако даже при соблюдении всех этих условий процент разделившихся клеток остается очень низким. Более эффективны методы «кормящего слоя» или «ткани-няньки». Для создания «кормящего слоя» берут суспензию клеток того же вида растения. Клеточная суспензия должна находиться в ранней стадии ростового цикла. Каллусная культура, служащая «тканью-нянькой», также должна быть в стадии активного роста. При достижении колонией, выросшей из отдельной клетки, размера 0,5-1 мм, она может быть перенесена для дальнейшего выращивания на агаризованную питательную среду непосредственно либо на фильтр, помещенный на поверхность питательного агара. Использование «кормящего слоя», «ткани- няньки» или минимального объема среды, в которую помещается отдельная клетка, связано с явлением, называемым «действие фактора кондиционирования». Несмотря на многочисленные попытки определить природу веществ, индуцирующих деление отдельной клетки и механизм действия фактора кондиционирования, данный вопрос окончательно не решен.
11.4. Протопласты растительных клеток
11.4.1. Методы выделения растительных протопластов
Протопласты растений – это ограниченные мембраной цитоплазматические образования, несущие внутриклеточные органоиды, характеризующиеся структурной целостностью и способностью осуществлять активный метаболизм и выполнять биосинтез и трансформацию энергии. Впервые выделение растительных протопластов было осуществлено в 1892 году Дж. Клеркером.
Наиболее простыми, хотя длительными и трудоемкими методами получения растительных протопластов являются механические. При этом фрагмент растительной ткани вносят в концентрированный раствор сахарозы, выдерживают до тех пор, пока протопласты не сожмутся и не отойдут от клеточных стенок, а затем аккуратно рассекают эпидермис, и протопласты выходят в среду. Однако при применении даже модифицированных механических методов можно получить только ограниченное число протопластов.
Принципиально отличный метод получения изолированных протопластов – энзиматический, при котором для удаления клеточной стенки используют ферменты. В сравнении с механическим методом ферментативное выделение протопластов имеет определенные преимущества. В этом случае сравнительно быстро и одновременно можно получать большое количество протопластов, которые не подвергнуты сильному осмотическому сжатию. При этом клетки становятся более интактными.
Для удаления клеточной стенки используются ферментные препараты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы – чаще всего грибного или бактериального происхождения. В результате обработки тканей ферментными препаратами образуется смесь, содержащая протопласты, обломки разрушенных клеток и целые клетки. Чтобы отделить протопласты от примесей, суспензию фильтруют через нейлоновые фильтры, а затем подвергают центрифугированию в мягких условиях.
Источником получения протопластов, помимо фрагментов растительных тканей, являются клеточные суспензии и каллусные культуры. Выделение протопластов достаточно легко выполнимая и технически хорошо отработанная процедура, однако сложность заключается в получении жизнеспособных протопластов и их дальнейшем культивировании. Успех процесса зависит от многих факторов – состава и качества ферментов, рН среды, выбора осмотического раствора, состояния растительного материала, а также применяемых методов получения и культивирования протопластов. Для стабильного получения большого количества протопластов важны стандартные условия выращивания исходных растений или клеток, определение оптимального для выделения протопластов возраста растения или органа, температуры, освещения, питания. Для получения протопластов из суспензионных клеточных культур наилучшей является поздняя логарифмическая фаза роста, когда клеточные стенки лучше всего поддаются ферментативному разрушению, а протопласты наиболее жизнеспособны.
11.4.2. Культивирование растительных протопластов
Для культивирования протопластов можно использовать метод жидких капель, при котором суспензия протопластов (в виде капель в жидкой среде) помещается в пластиковые чашки Петри. Метод обеспечивает хороший газообмен и диффузию в раствор экскретируемых продуктов и позволяет добавлять свежий раствор в нужной концентрации. Однако в этом случае протопласты агрегируются в центре каждой капли и образуют значительное количество фенольных или других токсических соединений. Метод также неудобен, если требуется исследовать развитие индивидуальной колонии протопластов.
Другой распространенный метод – метод агаровой культуры, при котором определенный объем суспензии протопластов в жидкой питательной среде наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем аналогичной среды, содержащей 1 % агар-агара, расплавленного и охлажденного до 45°С. Чашки заклеивают пленкой (парафильмом) и культивируют при 28°С. Протопласты фиксированы в одном положении и отдалены один от другого. Этот метод имеет важное преимущество, позволяя наблюдать все этапы развития конкретного протопласта: формирование клеточной стенки, деление клеток, рост и развитие растения. Недостаток этого метода заключается в том, что возможно некоторое повреждение протопластов при смешивании с теплым агар-агаром.
Одним из вариантов данной методики является использование «кормящих» протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или гамма-излучения, которые смешиваются с жизнеспособными протопластами. Причем доза облучения выбирается такой, чтобы клетки утратили способность к клеточному делению, но поддерживали и стимулировали рост других клеток. Этот метод позволяет культивировать суспензию протопластов более низкой концентрации, чем та, что обычно необходима для их роста.
Похожим является метод совместных культур, используемый для трудно культивируемых протопластов. Такие протопласты культивируются совместно с протопластами, отличающимися быстрым ростом. Успех культивирования основан на активных веществах, которые выделяются быстрорастущими видами.
Удобным вариантом метода жидких капель является культивирование в малом объеме (до 1 мкл) единичных протопластов (микроизоляция). В микрокаплях соотношение объема клетки к объему питательной среды такое же, как в культуре плотностью около1000 кл/мл.
По питательным потребностям изолированные протопласты сходны с целыми клетками. Поэтому питательные среды подобны таковым для клеточных культур. Поскольку центральная проблема при культивировании растительных объектов на искусственных питательных средах – создание определенной буферной емкости смеси, то обычно используют сопряженные пары солей, в которые объединяют химически и физиологически кислые и щелочные соли. К основным сопряженным парам относятся соли, содержащие азот и фосфор. Среды содержат железо в хелатной форме и сахарозу как источник углерода. Для индукции деления протопластов эффективно добавлять в среду цитокинины. Температура культивирования является видоспецифичной и варьирует в широких пределах. Температурный режим должен строго выдерживаться, так как протопласты чувствительны даже к незначительным отклонениям от оптимальной температуры. Оптимальные значения освещенности могут варьировать от абсолютной темноты до яркого света. Существенным фактором культивирования является плотность засева протопластов. При низкой плотности протопласты часто не делятся, в то время как при очень высокой возникают затруднения на поздних этапах культивирования из-за появления в ростовой среде токсичных продуктов обмена. Оптимальная плотность протопластов в культуре составляет103 -105 кл/мл.
Таким образом, используя разнообразные методы, учитывая характерные особенности исходного материала и соблюдая все условия, можно осуществить культивирование растительных протопластов, добиваясь получения целого растения из единичных протопластов. Разработка техники культивирования растительных клеток, получения и культивирования растительных протопластов послужила основой для создания методов биологического конструирования растений с заданными свойствами.
В 1922 году В. Роббинс и Котте независимо друг от друга показали возможность культивирования на синтетических питательных средах клеток меристемы корня томатов и кукурузы. Эти опыты положили начало применению метода культивирования изолированных клеток и органов растений. В 30-60-е годы ХХ века благодаря работам большого числа ученых (Ф. Уайт, Р. Готре и других) число видов растений, клетки и ткани которых выращивали in vitro, превысило 150.
Были описаны составы питательных сред, определены потребности культур в витаминах и стимуляторах роста, разработаны методы получения и выращивания больших масс клеточных суспензий, а также культивирования отдельной, выделенной из суспензии клетки. С использованием изолированных протопластов были разработаны методы гибридизации соматических клеток путем слияния протопластов с помощью полиэтиленгликоля и введения в них вирусных РНК, клеточных органелл, клеток бактерий. С помощью метода культуры меристем были получены безвирусные экономически важные растения с высоким коэффициентом размножения.
В настоящее время активно продолжается разработка методов глубинного культивирования клеток, слияния изолированных протопластов и т. д. Такие исследования привели к появлению более продуктивных и приспособленных к условиям культивирования клеточных штаммов, используемых для создания новых форм и сортов сельскохозяйственных, лекарственных, декоративных и других растений.
§
11.2.1. Поверхностное культивирование
Культура каллусных тканей выращивается поверхностным способом на полужидкой агаризованной среде (концентрация агара – 0,6-1 %), среде с применением других желирующих полимеров либо на мостиках из фильтровальной бумаги или дисках из пенополиуретана, погруженных в жидкую питательную среду. Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенной анатомической структуры. Цвет массы может быть белым, желтоватым, зеленым или красным; пигментированным полностью или зонально. Как правило, в длительной пересадочной культуре каллусные ткани теряют пигментацию и становятся более рыхлыми. Каллусные клетки, выращиваемые поверхностным способом, часто применяют для сохранения в растущем состоянии коллекций разных штаммов, линий, мутантов, для регенерации растений, из них также получают суспензии клеток, культивируемых в жидкой питательной среде.
11.2.2. Суспензионное культивирование
Культуры клеток растений, выращиваемые в жидкой питательной среде, обычно называют суспензионными (глубинными) культурами. Существуют определенные проблемы получения культуры, состоящей преимущественно из отдельных клеток или небольших их агрегатов. Для решения этих проблем используют методы получения клеточной суспензии применительно к растительным клеткам.
Выращивание клеточных суспензий в жидкой питательной среде имеет ряд преимуществ перед выращиванием каллусных клеток поверхностным способом. Суспензионные культуры удобнее для проведения биохимических и молекулярно-биологических экспериментов – изучения индукции ферментов и связи их с событиями клеточного цикла, экспрессии и репрессии определенных генов, изолирования и характеристик мутантов.
Суспензионную культуру можно получить из фрагментов органа растения (диски паренхимы и др.), хотя этот путь более трудоемкий и требует большего времени. Клетки экспланта должны при этом образовывать первичный каллус, и только после этого поверхностные каллусные клетки, попавшие в жидкую среду и размножившиеся в ней, дадут начало линии, способной расти в суспензии. Обычно для получения культуры клеток используется культура каллусной ткани. Для получения культуры клеток берется наиболее жизнеспособная (пролиферирующая) часть каллусной ткани, а ее количество в расчете на единицу объема питательной среды должно быть в 15-20 раз больше, чем при серийном культивировании на агаре. При этом может использоваться питательная среда того же состава, что и для поверхностного культивирования.
Образование первичной суспензии растительных клеток может быть результатом трех процессов:
– распада каллусной ткани на клетки и небольшие клеточные агрегаты в момент внесения в жидкую питательную среду;
– отделения клеток и клеточных агрегатов с поверхности кусочков ткани в течение первых субкультивирований;
– деления и роста клеток и распада разрастающихся клеточных агрегатов на более мелкие агрегаты и клетки.
Первичную суспензию перед субкультивированием разделяют на фракции по скорости седиментации, используя специальный цилиндр (берут верхнюю фракцию), либо фильтруют через 1-2 слоя марли, нейлоновые или металлические сита, чтобы избавиться от крупных плотных кусков каллусной ткани, остатков экспланта и очень крупных агрегатов.
Для глубинного культивирования растительных клеток применяют методы, разработанные для микробиологических целей. Используют закрытые или открытые системы в периодическом или проточном режимах. Однако при глубинном выращивании растительных клеток принцип турбидостата практически не применяется. Одной из причин этого является разрушения части клеток при отводе их к оптическому прибору. Выращивание суспензии клеток растений в установках непрерывного культивирования по принципу хемостата применяется как для изучения метаболизма клеток, стабильно поддерживающихся в разных фазах клеточного цикла, так и при промышленном выращивании клеточной биомассы с целью получения экономически важных продуктов.
Наиболее изученным и распространенным режимом глубинного культивирования клеточных суспензий в настоящее время является закрытая периодическая система. В этом случае для аэрации и перемешивания суспензии используют роллеры, качалки (обычно круговые), ферментеры с механическими и магнитными мешалками или ферментеры барботажного типа, где аэрация и перемешивание осуществляется воздушным потоком. Критериями роста в цикле выращивания служит увеличение числа клеток, их сырой и сухой массы. Модельная ростовая кривая имеет типичную S-образную форму, на которой различают: I – лаг-фазу; II – экспоненциальную фазу; III – фазу линейного роста; IV -замедленного роста; V – стационарную фаза; VI – фазу отмирания (рис. 11).
Рис. 11. Кривая роста клеточных суспензий в закрытой периодической системе
В латентной фазе (лаг-фазе) видимого роста инокулята не наблюдается. При этом наблюдается высокая интенсивность дыхания, максимальные значения энергетического уровня, интенсивный синтез ДНК, РНК, белков и других компонентов клетки, но низкий митотический уровень. Длительность фазы зависит от количества и физиологического состояния инокулята и условий культивирования. Экспоненциальная фаза характеризуется максимальными скоростью роста и величинами митотической активности, а также преобладанием мелких клеток меристематического типа. На протяжении линейной фазы скорость роста постоянна. Фаза замедленного роста связана с субстратным лимитированием и ингибированием продуктами обмена. Для стационарной фазы характерна малая скорость деградации клеток, которая уравновешивается делением клеток. В фазе отмирания клеток удельная скорость роста принимает отрицательное значение.
Форма реальных ростовых кривых может значительно отличаться продолжительностью фаз от модельной. Процессы ростового цикла зависят от вида растения, количества внесенного материала и условий культивирования (состав питательной среды, температура, начальное значение рН, состав газовой фазы, скорость перемешивания). Первичный и вторичный метаболизм культивируемых клеток растений видоспецифичен, зависит от типа дифференцировки исходных клеток растения и регулируется условиями выращивания. Генетическая изменчивость клеток как следствие их культивирования вне организма приводит к возникновению из первичной каллусной ткани генетически и фенотипически различающихся линий клеток. Это позволяет отобрать или экспериментально создать линии, сохраняющие биосинтетические системы, характерные для исходного растения, и линии, синтезирующие принципиально новые вещества.
§
11.4.1. Методы выделения растительных протопластов
Протопласты растений – это ограниченные мембраной цитоплазматические образования, несущие внутриклеточные органоиды, характеризующиеся структурной целостностью и способностью осуществлять активный метаболизм и выполнять биосинтез и трансформацию энергии. Впервые выделение растительных протопластов было осуществлено в 1892 году Дж. Клеркером.
Наиболее простыми, хотя длительными и трудоемкими методами получения растительных протопластов являются механические. При этом фрагмент растительной ткани вносят в концентрированный раствор сахарозы, выдерживают до тех пор, пока протопласты не сожмутся и не отойдут от клеточных стенок, а затем аккуратно рассекают эпидермис, и протопласты выходят в среду. Однако при применении даже модифицированных механических методов можно получить только ограниченное число протопластов.
Принципиально отличный метод получения изолированных протопластов – энзиматический, при котором для удаления клеточной стенки используют ферменты. В сравнении с механическим методом ферментативное выделение протопластов имеет определенные преимущества. В этом случае сравнительно быстро и одновременно можно получать большое количество протопластов, которые не подвергнуты сильному осмотическому сжатию. При этом клетки становятся более интактными.
Для удаления клеточной стенки используются ферментные препараты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы – чаще всего грибного или бактериального происхождения. В результате обработки тканей ферментными препаратами образуется смесь, содержащая протопласты, обломки разрушенных клеток и целые клетки. Чтобы отделить протопласты от примесей, суспензию фильтруют через нейлоновые фильтры, а затем подвергают центрифугированию в мягких условиях.
Источником получения протопластов, помимо фрагментов растительных тканей, являются клеточные суспензии и каллусные культуры. Выделение протопластов достаточно легко выполнимая и технически хорошо отработанная процедура, однако сложность заключается в получении жизнеспособных протопластов и их дальнейшем культивировании. Успех процесса зависит от многих факторов – состава и качества ферментов, рН среды, выбора осмотического раствора, состояния растительного материала, а также применяемых методов получения и культивирования протопластов. Для стабильного получения большого количества протопластов важны стандартные условия выращивания исходных растений или клеток, определение оптимального для выделения протопластов возраста растения или органа, температуры, освещения, питания. Для получения протопластов из суспензионных клеточных культур наилучшей является поздняя логарифмическая фаза роста, когда клеточные стенки лучше всего поддаются ферментативному разрушению, а протопласты наиболее жизнеспособны.
11.4.2. Культивирование растительных протопластов
Для культивирования протопластов можно использовать метод жидких капель, при котором суспензия протопластов (в виде капель в жидкой среде) помещается в пластиковые чашки Петри. Метод обеспечивает хороший газообмен и диффузию в раствор экскретируемых продуктов и позволяет добавлять свежий раствор в нужной концентрации. Однако в этом случае протопласты агрегируются в центре каждой капли и образуют значительное количество фенольных или других токсических соединений. Метод также неудобен, если требуется исследовать развитие индивидуальной колонии протопластов.
Другой распространенный метод – метод агаровой культуры, при котором определенный объем суспензии протопластов в жидкой питательной среде наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем аналогичной среды, содержащей 1 % агар-агара, расплавленного и охлажденного до 45°С. Чашки заклеивают пленкой (парафильмом) и культивируют при 28°С. Протопласты фиксированы в одном положении и отдалены один от другого. Этот метод имеет важное преимущество, позволяя наблюдать все этапы развития конкретного протопласта: формирование клеточной стенки, деление клеток, рост и развитие растения. Недостаток этого метода заключается в том, что возможно некоторое повреждение протопластов при смешивании с теплым агар-агаром.
Одним из вариантов данной методики является использование «кормящих» протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или гамма-излучения, которые смешиваются с жизнеспособными протопластами. Причем доза облучения выбирается такой, чтобы клетки утратили способность к клеточному делению, но поддерживали и стимулировали рост других клеток. Этот метод позволяет культивировать суспензию протопластов более низкой концентрации, чем та, что обычно необходима для их роста.
Похожим является метод совместных культур, используемый для трудно культивируемых протопластов. Такие протопласты культивируются совместно с протопластами, отличающимися быстрым ростом. Успех культивирования основан на активных веществах, которые выделяются быстрорастущими видами.
Удобным вариантом метода жидких капель является культивирование в малом объеме (до 1 мкл) единичных протопластов (микроизоляция). В микрокаплях соотношение объема клетки к объему питательной среды такое же, как в культуре плотностью около1000 кл/мл.
По питательным потребностям изолированные протопласты сходны с целыми клетками. Поэтому питательные среды подобны таковым для клеточных культур. Поскольку центральная проблема при культивировании растительных объектов на искусственных питательных средах – создание определенной буферной емкости смеси, то обычно используют сопряженные пары солей, в которые объединяют химически и физиологически кислые и щелочные соли. К основным сопряженным парам относятся соли, содержащие азот и фосфор. Среды содержат железо в хелатной форме и сахарозу как источник углерода. Для индукции деления протопластов эффективно добавлять в среду цитокинины. Температура культивирования является видоспецифичной и варьирует в широких пределах. Температурный режим должен строго выдерживаться, так как протопласты чувствительны даже к незначительным отклонениям от оптимальной температуры. Оптимальные значения освещенности могут варьировать от абсолютной темноты до яркого света. Существенным фактором культивирования является плотность засева протопластов. При низкой плотности протопласты часто не делятся, в то время как при очень высокой возникают затруднения на поздних этапах культивирования из-за появления в ростовой среде токсичных продуктов обмена. Оптимальная плотность протопластов в культуре составляет103 -105 кл/мл.
Таким образом, используя разнообразные методы, учитывая характерные особенности исходного материала и соблюдая все условия, можно осуществить культивирование растительных протопластов, добиваясь получения целого растения из единичных протопластов. Разработка техники культивирования растительных клеток, получения и культивирования растительных протопластов послужила основой для создания методов биол КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК
Возможность сохранения живых тканей вне организма в 1885 году показал У. Ру (W. Roux), который сохранял в жизнеспособном состоянии оболочку куриного эмбриона в теплом физиологическом растворе. Позднее, в 1897 году, Леб (Loeb) поддерживал в жизнеспособном состоянии клетки крови и соединительной ткани в пробирках с сывороткой и плазмой крови. Льюнгрен (1898) показал возможность поддержания эксплантатов кожи человека в жизнеспособном состоянии в кислой среде с сохранением способности к реимплантации. В 1913 году А.Каррель применил плазму крови, обогащенную экстрактом эмбриона. Этот процесс был продолжен на протяжении длительного времени и назван как культивирование «бессмертных» клеток. Таким образом, признание идеи о том, что клетки тканей высших животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro, датируется первым десятилетием XX века.
После того как стало известно, что подобные процессы реальны, была продемонстрирована возможность выращивания и репродукции в таких клетках фильтрующихся инфекционных агентов – вирусов и получение в больших количеств вирусного материала для применения в вакцинных препаратах. Появилась возможность встраивать в клетки специфические экзогенно полученные гены и получать их экспрессию, а также выращивать в культуре из одиночной клетки целой популяции. Когда такие популяции стали получать из клетки, выделявшей in vitro антитела, то все молекулы антител в надосадочной жидкости оказались одинаковыми.
Культивирование клеток и тканей животных к настоящему времени получило широкое распространение в различных областях исследований – от клеточной и молекулярной биологии до быстро прогрессирующих прикладных областей биотехнологии. Культуру животных тканей применяют для изучения механизмов роста и дифференцировки клеток, межтканевых и межклеточных взаимодействий, обмена веществ и т. п. Культуры животных клеток являются важными продуцентами многих биологически важных веществ. На них выращивают вирусы для их идентификации и получения вакцин. Клеточные культуры часто применяют при тестировании и изучении механизма действия лекарственных и косметических средств, пестицидов, консервантов.
Методы культуры клеток нашли широкое применение для реконструкции различных тканей и органов. Так, культура клеток кожи используется для заместительной терапии при ожогах, культура клеток эндотелия – для реконструкции стенок сосудов. Способность клеток к росту в культуре привела к развитию методов клонирования, хранения и слияния клеток, что, в свою очередь, вызвало становление новой области науки – генетики соматических клеток. Органные культуры используют при изучении закономерностей развития органов, способов сохранения жизнеспособности изолированных органов, предназначенных для трансплантации.
Чтобы показать способность клеток животных расти и делиться в культуре, потребовалось овладеть рядом подходов и методик. В их числе методы получения клеток, свободных от экзогенных прокариот и грибов; разработки сред, в которых рост «вырезанных из ткани» или изолированных клеток не подавляется; наблюдения за клетками в динамике их развития; непрерывного культивирования культур клеток животных in vitro и поддержания их свободными от других биологических агентов.
Научную основу для разработки этих методик составляет представление о клетке как основном структурном элементе живых организмов животного и растительного происхождения. Идея о том, что клетки тканей животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro возникла на базе концепции, принадлежащей Клоду Бернару. Он предположил, что не только живые организмы способны сохранять постоянство внутренних условий вне зависимости от изменений в окружающей среде. Клетка вне организма животного тоже будет стремиться поддерживать свои внутренние условия. И если различия между внутренними и внешними условиями будут незначительными, то высока вероятность роста и деления клетки. Такое понимание явления привело к необходимости разработки сред, способных поддерживать и стимулировать рост клеток вне организма. В ходе проделанных работ был внесен ряд поправок в рецептуру среды культивирования, разработан дополнительный и очень существенный подход в технике работы с клетками, прежде всего, применение трипсина для высвобождения клеток из тканевой матрицы, в которой они находятся.
Впервые клоны клеток в культуре из одиночной клетки были получены Эрлом с сотрудниками в 1948 году. Игл (1955) систематически исследовал пищевые потребности клеток. До тех пор, пока в 1961 году Хейфлик и Мурхед не выделили линию диплоидных клеток человека (НДС) WI-38, считалось, что один раз установившаяся клеточная линия имеет неограниченное время жизни. Однако период ее существования в культуре ограничивался приблизительно 50 генерациями популяции, а при отмирании эти клетки оставались диплоидными и не имели признаков старения и злокачественных изменений. Клетки, выделенные из раковых опухолей или трансформированные в ходе культивирования, характеризуются «бессмертностью» и коррелируют с гетероплоидностью. И первые полученные суспензионные культуры клеток животных, как правило, основывались на клетках злокачественных тканей (клетки Hela).
Последующий этап в истории культивирования диплоидных клеток человека связан с установлением факта, что они являются генетически стабильными и свободными от всех известных латентных и онкогенных вирусов. Поэтому линии диплоидных клеток человека разрешено применять
для получения продуктов, предназначаемых для людей. Эта догма остается действующей и в настоящее время, хотя новейшие открытия отчетливо показали присутствие в клетках, выделенных из нормальных тканей, потенциальных онкогенов. Эти онкогены идентичны тем, которые найдены в известных онкогенных вирусах (вирусы саркомы). Позднее было установлено, что ряд вирусов способен индуцировать возникновение опухолей, и такие вирусы были названы онкогенными.
12.1. Характеристика клеток, культивируемых in vitro
Клетки одного и того же типа в ткани взаимодействуют друг с другом и согласовывают скорость деления, чтобы поддерживать надлежащую плотность популяции. Контроль такого рода четко проявляется при реакциях на повреждение. Например, когда поврежден эпителий, клетки по краям раны стимулируются к делению и наползанию на обнаженную поверхность до тех пор, пока она вновь не будет закрыта, после чего пролиферация и движение клеток прекращаются. Сходное явление можно наблюдать на диссоциированных клетках в культуре. Эпителиальные клетки или фибробласты, помещенные в чашку, в присутствии сыворотки будут «приклеиваться» к поверхности, распластываться и делиться до тех пор, пока не образуется сплошной монослой, в котором соседние клетки соприкасаются.
Нормальные клетки перестают делиться, и это явление известно, как торможение пролиферации, зависимое от плотности. Если такой монослой «поранить» иглой следующим образом, чтобы на чашке образовалась свободная от клеток полоска, клетки с краев этой полоски начинают продвигаться на свободное место и делиться.
Плотность клеточной популяции, при которой клетки в сплошном монослое перестают делиться, увеличивается с повышением концентрации факторов роста в среде. Кроме того, оказалось, что если культуральная жидкость будет протекать по поверхности чашки с островками
клеток, то клетки, омываемые средой, только что прошедшей над другими клетками, будут делиться медленнее, чем те, которые омываются средой, прошедшей над свободными от клеток участками. В среде, протекавшей над клетками, недостает каких-то важных питательных веществ или факторов роста.
Фактор роста обычно присутствует в среде в концентрации около 10-10 М (примерно одна молекула в объеме сферы диаметром 3 мкм), и у каждой клетки достаточно рецепторов, чтобы связать все молекулы ростовых факторов. Конкуренция за факторы роста и питательные вещества не единственный фактор, влияющий на скорость деления в клеточной культуре. Форма клеток вовремя их распластывания и движения по поверхности субстрата на свободные места тоже сильно влияет на их способность делиться. При культивировании нормальных клеток в суспензии, когда они не прикреплены к твердой поверхности и поэтому имеют округлую форму, они почти никогда не делятся.
Влияние распластывания клеток на пролиферацию можно наблюдать при выращивании клеток на субстратах с различной адгезивностью поверхности или на таких субстратах, где имеются лишь крошечные адгезивные участки, на которых клетка может прикрепиться, но не может распластаться. При этом частота деления клеток возрастает с увеличением степени их распластывания. Возможно, что сильно распластанные клетки могут улавливать больше ростовых факторов и поглощать питательных веществ с увеличением своей поверхности.
Изменение ростовых свойств культивируемых клеток называется трансформацией. Трансформированные клетки способны расти в условиях, при которых отношение площади поверхности к объему менее благоприятны. Трансформированные клетки не имеют ограниченной продолжительности жизни, и это обусловливает такое их преимущество в биотехнологии, как использование в качестве субстрата.
В настоящее время практически любые клетки человека и животных могут быть введены (или уже введены) в культуру и тем самым служить средством и объектом во многих медико-биологических исследованиях. В их числе элементы соединительной ткани человека (фибробласты), скелетные ткани (кость и хрящи), сердечные и гладкие мышцы, эпителиальные ткани (печень, легкие, почки и др.), клетки нервной системы, эндокринные клетки, меланоциты и различные опухолевые клетки.
Наибольшее распространение получили культуры фибробластов. Это связано с легкостью их культивирования, а также с тем, что они составляют значительную часть массы тела и строму многих органов. Была доказана возможность экстраполяции данных, полученных на культивируемых фибробластах, на условия in vivo (Гринберг, 1978). Основные доказательства заключаются в следующем. Во-первых, фибробласты in vitro сохраняют важнейшие черты, свойственные клеткам в организме, а также онтогенетические и индивидуально генотипические свойства организма- донора. Во-вторых, не существует другого такого типа клеток, который в полной мере мог бы представлять свойства клеток организма. В-третьих, изменения, которые возникают при введении фибробластов в культуру, можно легко контролировать и свести к минимуму при создании соответствующих условий.
Можно выделить два направления культивирования животных клеток: культуры клеток и культуры органов и тканей (органные культуры). Клетки в культурах размножаются, что обеспечивает получение большой массы клеток. Затем их идентифицируют, разделяют на идентичные параллели и, если необходимо, сохраняют. Поскольку динамические свойства культивируемых клеток бывает трудно контролировать и реконструировать in vitro некоторые клеточные взаимодействия, наблюдаемые in vivo, то отдано предпочтение использованию клеточных систем, сохраняющих структурную целостность исходной ткани.
Популяция клеток не всегда гомогенна и обладает фиксированным фенотипом. Некоторые культуры, например, клетки эпидермиса, содержат стволовые клетки, клетки-предшественники и чешуйчатые клетки. В такой культуре происходит постоянное обновление за счет стволовых клеток, пролиферация и созревание клеток-предшественников, а также необратимая дифференцировка, сопровождающаяся «слущиванием» чешуйчатых клеток в культуральную среду.
12.2. Культуральные системы животных клеток
Для введения в культуру лучше брать клетки, полученные из эмбриональных тканей. Они характеризуются лучшей выживаемостью и более активным ростом по сравнению с соответствующими клетками зрелых тканей. Причиной этого служит низкий уровень специализации и наличие реплицирующихся клеток-предшественников в эмбрионах. Пролиферативная способность взрослых тканей ниже, они содержат больше неделящихся специализированных клеток.
Различают три основных типа культур животных клеток: первичные культуры, получаемые практически из любого органа и существующие лишь до первого пересева; диплоидныекультуры, чаще получаемые из эмбриональных тканей и сохраняющие диплоидный набор хромосом до 50 пересевов, которые затем трансформируются в постоянные(перевиваемые) гетероплоидные культуры, существующие вне организма десятки лет. Кроме того, культуры тканей могут подразделяться по виду животного, от которого они происходят; по типу ткани-источника; по состоянию ткани на момент извлечения (нормальные, опухолевые), по способу выращивания (монослойные, суспензионные, на микроносителях и т. п.). Главным фактором при выборе ткани или линии клеток для дальнейшего исследования является природа процесса, который будет изучаться на этих клетках.
12.2.1. Первичные культуры
Клетки, полученные от животного и поддерживаемые в культуре, называют первичными до тех пор, пока они не будут пассированы (субкультивированы), то есть до первого пересева. Клетки первичной культуры обычно гетерогенны и характеризуются низкой пролиферацией. В них наиболее полно представлены типы клеток той ткани, откуда они были получены. Однако первичная культура лишена многих клеток, присутствующих в исходной ткани, поскольку не все клетки способны прикрепиться к субстрату и выжить в условиях in vitro.Пассирование обеспечивает возможность продления существования культуры, возможность клонирования, исследования и сохранения свойств клеток. При этом получаются более однородные популяции, а также теряются специализированные клетки.
Первичные культуры клеток получают путем стерильного удаления фрагмента ткани и его механической или ферментативной дезагрегации. В случае механической дезагрегации фрагмент ткани измельчают до кусочков размером около 1 мм, которые прикрепляются к субстрату благодаря собственной адгезивности, поверхности субстрата или сгустку плазмы. Ферментативная дезагрегация, использующая 0,01-0,25 % трипсина или 200-2000 ед./мл коллагеназы, дает более высокий выход клеток, хотя метод является селективным, поскольку не все клетки переживают диссоциацию. Главным преимуществом получения клеточных линий из первичных культур является наработка большого количества стабильного материала, пригодного для продолжительного использования.
12.2.2. Постоянные культуры
После нескольких пересевов линия клеток либо гибнет, либо трансформируется и становится постоянной клеточной линией. Появление постоянной линии клеток констатируется по морфологическим изменениям (уменьшению размера клеток, снижению их адгезивности, округлению, увеличению ядерно-цитоплазматического соотношения), по увеличению скорости роста (время удвоения клеток снижается с 36-48 до 12-36 часов), по снижению зависимости от сыворотки и субстрата и, следовательно, их способности к росту в суспензии; по увеличению гетероплоидности (хромосомные различия между клетками), а также по увеличению опухолеродности. Однако нормальные клетки, спонтанно трансформируясь в постоянную линию, несмотря на некоторые черты сходства, не становятся при этом злокачественными. Таким образом, преимуществом постоянных клеточных линий являются высокая скорость роста, возможность достижения более высокой плотности, способность к суспензионному росту, а также возможность использования более дешевых сред. К числу недостатков относятся повышенная хромосомная нестабильность, отклонение от фенотипа донора и утрата специфических маркеров.
12.3. Питательные среды и условия культивирования
После извлечения клеток из ткани или организма используемая для выращивания культуральная среда должна обеспечивать все внешние условия, которые клетки имели in vivo. Это способствует выживанию клеток, их пролиферации и дифференцировке. Внеклеточная среда должна обеспечивать клетки питательными и гормональными факторами, то есть обладать всем необходимым для роста и выживания клеток.
Культуры клеток животных и человека предъявляют определенные требования к жидкой (питательная среда), газообразной (концентрация газов) и твердой (поверхность субстрата) фазе. Основу питательных сред составляют солевые растворы. Минеральные компоненты в этих растворах подобраны так, что раствор выполняет буферные функции, поддерживая постоянный кислотно-щелочной баланс среды в процессе культивирования. Постоянство рН-среды является одним из главных условий культивирования.
Для приготовления питательных сред обычно используются солевые растворы Эрла и Хенкса. Эти растворы, как и фосфатно-солевой буфер Дульбекко и Фогта, используются также для орошения и промывки клеток при пассировании культур, выделении клеточных линий и других манипуляциях с культурами клеток. Другим важным условием культивирования является осмотическое давление. Оно определяется числом молей осмотически активных частиц (ионов и неионизированных молекул) растворенных веществ на 1 кг растворителя (осмоляльность) или на 1 литр раствора (осмолярность). Диапазоны рН и осмоляльности, при которых происходит размножение клеток, узки и варьируют в зависимости от типа клеток. Для поддержания рН в большинстве сред используется бикарбонатный буфер. Растворы могут содержать малое количество бикарбонатного буфера (раствор Хенкса), они предназначены для поддержания рН в плотно закрытых сосудах. В других (растворе Эрла) бикарбоната больше, они используются в системах с повышенным парциальным давлением СО2. Если культуры выращивают вне СО2-инкубатора, где рН поддерживать труднее, используют альтернативные буферные системы. Хорошим буфером является HEPES 4-(2-оксиэтил)1- пиперазинэтансульфоновая кислота. HEPES легко растворим в воде, не связывает двухвалентные катионы, не цитотоксичен до концентрации 0,05 Моль.
Разработка питательных сред для культур животных клеток развивалась в двух направлениях – сред, содержащих природные добавки (сыворотки, эмбриональные экстракты и другие), и сред химически определенного состава. В настоящее время наиболее широко применяются среды, содержащие источники энергии (углеводы) и азота, незаменимые аминокислоты, витамины, неорганические соли (источники макро- и микроэлементов), нуклеозиды, жиры и жирорастворимые компоненты, гормоны, ростовые факторы, а также сыворотку (до 10 %) и некоторые другие добавки.
Сыворотка представляет собой смесь мелких и крупных молекул, которые могут как способствовать, так и тормозить рост клеток. К главным функциям сыворотки относятся обеспечение гормональными факторами, стимулирующими рост клеток и их функции; обеспечение факторами прикрепления и распластывания клеток; обеспечение транспортными белками, переносящими гормоны, минеральные вещества, липиды и т. д. Белки сыворотки, прямо и специфически участвующие в стимуляции клеточного деления, называются факторы роста. Один и тот же тип клеток может быть стимулирован различными ростовыми факторами.
Для переноса низкомолекулярных факторов (витаминов, аминокислот, липидов и других) необходимы транспортные белки. В этой роли выступает альбумин. К факторам прикрепления и распластывания клеток относятся коллаген.
Культивирование клеток в присутствии сыворотки обнаруживает ряд недостатков. Это связано с тем, что для большинства клеток сыворотка не является физиологической жидкостью, с которой они контактировали в исходной ткани. Кроме того, сыворотки могут содержать недостаточное количество специфических для данного вида клеток ростовых факторов, изменять биологические свойства в зависимости от серии, а в некоторых случаях проявлять цитотоксическое действие.
В последние годы разработаны бессывороточные среды, содержащие смесь гормонов и ростовых факторов. Бессывороточные среды имеют определенные преимущества. Они нетоксичны, обеспечивают лучшую воспроизводимость результатов опыта вследствие стабильности состава среды, снижают риск заражения культуры вирусами, грибами, микоплазмами. Такие среды снижают влияние сывороточных белков на результаты биологических исследований, их легче очистить от продуктов клеточного метаболизма. Однако бессывороточные среды имеет существенные недостатки. В частности, добавление в среду гормонов и факторов роста делает ее такой же дорогой, как среда с сывороткой. Кроме того, бессывороточные среды чаще пригодны для ограниченного числа клеток.
Из наиболее распространенных стандартных сред для культур животных клеток следует отметить среду Игла MEM (minimal essential medium) и BME (basal medium, Eagle). Чаще используется МЕМ, которая содержит минеральные вещества, аминокислоты, водорастворимые витамины, холин и инозит, выполняющие роль углеводного субстрата. МЕМ используется только с сывороткой, так как в ней отсутствуют биотин, витамин В12, ионы железа и микроэлементы. Основа ее – раствор Эрла. Помимо перечисленных, используются среда Дульбекко, Искова, Мак Коя и 199 с сывороткой для быстро размножающихся клеток.
12.4. Системы культивирования клеток
Существует две основных системы культивирования клеток: проточные и непроточные культуры.
Непроточными называют системы культивирования, в которых клетки вводят в фиксированный объем среды. Такие системы пригодны для культивирования клеток как в монослое, так и в суспензии. По мере роста клеток происходит использование питательных веществ и накопление метаболитов, поэтому среда должна периодически меняться, что приводит к изменению клеточного метаболизма, называемого еще и физиологической дифференцировкой. Со временем в результате истощения среды происходит прекращение пролиферации клеток. Для увеличения продолжительности жизни непроточных культур используют несколько способов: замена части культуры равным объемом свежей среды (прерывистый способ); увеличение объема культуры с постоянной низкой скоростью при периодическом удалении небольших порций клеток (постоянный способ); постоянное поступление в культуру свежей среды и одновременное удаление равного объема использованной бесклеточной среды (перфузионный способ). Причем перфузия может быть открытой, когда из системы удаляется вся среда, и закрытой, когда удаляемая среда проходит через дополнительный сосуд, где восстанавливается ее рН и осуществляется аэрирование, а среда возвращается в культуральный сосуд. Все системы непроточных культур характеризуются накоплением отходов в той или иной форме и непостоянством внешних условий.
Проточные культуры обеспечивают истинные гомеостатические условия без изменения концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Это единственная система, в которой все клетки гомогенны и сохраняют гомогенность в течение длительно периода. Гомеостаз обусловлен постоянным поступлением среды в культуру и одновременным удалением равного объема среды с клетками. Такие системы пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях.
12.5. Монослойные и суспензионные культуры
В культивировании животных клеток существует два крупных направления: монослойные и суспензионные культуры.
12.5.1. Монослойные культуры
Большинство нетрансформированных клеток млекопитающих могут расти только в виде монослоя, будучи прикрепленными к субстрату: к другим клеткам, к стеклу, пластику или металлу. Клетки прикрепляются за счет электростатических взаимодействий, поэтому поверхность культуральных сосудов должна быть смачиваемой и отрицательно заряженной. Для прикрепления клеток необходимо образование поперечных сшивок с гликопротеидами, а также присутствие двухвалентных катионов кальция и магния.
Первичные клетки, которые делятся в культуре, могут претерпевать так называемое контактное торможение движения. Первичные клетки не могут расти друг над другом, и в большинстве случаев достижение полного монослоя сопровождается прекращением клеточных делений. Этот феномен характерен не только для первичных клеток, но наблюдается также во многих клеточных линиях. Нетрансформированные клетки могут в течение некоторого времени сохранять жизнеспособность в таком покоящемся состоянии, но, если их не пересеять, они погибают. Из сыворотки было выделено несколько факторов, обладающих способностью снимать контактное торможение.
Ослабленным контактным торможением характеризуются клетки, трансформированные вирусами, и такие клетки могут достигать более высокой конечной плотности. Трансформированные клетки способны расти вплоть до полного истощения среды, и если после этого не наступает смена среды, то клетки быстро погибают. Монослойное культивирование осуществляют во флаконах (матрасах) или пробирках для культуры тканей, обеспечивающих поверхность роста 5-200 см2.
Монослойные культуры обладают рядом преимуществ:
– они создают возможность замены питательной среды и промывание клеток перед добавлением свежей питательной среды, что важно, когда рост клеток идет в одних условиях, а наработка продукта – в других (например, при переносе клеток из среды с сывороткой в бессывороточную среду);
– позволяют обеспечить высокую плотность клеток с использованием перфузионной (перфузия – обливание) техники;
– обеспечивают тесные межклеточные контакты (что требуется, например, для распространения вирусов);
– обеспечивают более выраженную экспрессию целевого продукта, поскольку клетки прикреплены к субстрату;
– пригодны для любого типа клеток и позволяют использовать одну и ту же аппаратуру с разным отношением клетка-среда, легко изменяемым в ходе эксперимента.
Однако для монослойных культур характерны определенные недостатки:
– наличие большого пространства;
– увеличение стоимости и трудоемкости при увеличении масштаба;
– недостаточно эффективный контроль, обусловленный отбором проб;
– трудности с определением и поддержанием таких параметров, как pH и содержание О2, и обеспечением гомогенности культуры клеток.
12.5.2. Суспензионные культуры
Для наращивания клеточной массы удобнее использовать не монослойные, а суспензионные культуры. Как правило, клетки, отделившиеся от субстрата, на котором они росли, неспособны к росту в суспензии и быстро деградируют. Но если некоторые клетки культивировать во вращающемся флаконе (2 об/мин), не дающем возможности прикрепления клеток к поверхности, в среде, содержащей метилцеллюлозу, предотвращающую агрегацию клеток, то можно получить жизнеспособные суспензионные клеточные штаммы. Иногда этого бывает достаточно для получения суспензионной культуры, но обычно требуются специальные сосуды для культивирования суспензий и использование среды с дефицитом ионов кальция и магния.
Суспензионные культуры также можно получать путем обработки, отобранной для пересева монослойной клеточной культуры 0,02 % раствором химопсина в фосфатно-солевом буфере или 0,1 % трипсином и 0,01 % ЭДТА. Суспензионные культуры лучше растут внутри ограниченного диапазона концентраций клеток и в том случае, когда сосуд наполнен средой наполовину.
Суспензионное культивирование первичных и перевиваемых клеточных линий проводят в роллерных установках (roll – вертеть, скручивать), где создаются благоприятные для клеток условия постоянного перемешивания жидкой и газовой фаз, общий объем среды при этом снижается вдвое по сравнению со стационарными условиями.
Суспензионное культивирование клеток также можно проводить в ферментерах, предназначенных для суспензионного культивирования микроорганизмов, в которых постоянное перемешивание клеток в среде осуществляется магнитными или механическими мешалками с высокой скоростью вращения, препятствующей прикреплению клеток к стенкам сосудов.
Суспензионное культивирование обеспечивает, по меньшей мере, 2-3-кратную экономию питательных сред, по сравнению с общепринятым стационарным монослойным культивированием при полном исключении дорогостоящих протеолитических ферментов и буферных растворов. Кроме того, суспензионные культуры представляются предпочтительными с точки зрения получения больших количеств биомассы.
12.5.3. Монослойное культивирование на микроносителях
Сочетать положительные стороны моносло<</div>
§
Основываясь на влиянии внешних условий на микроорганизмы, в микробиологической практике разработан ряд приемов, приводящих микроорганизмы к гибели. Одним из таких приемов является стерилизация.
Под стерилизацией (обеспложиванием) понимают полное уничтожение микроорганизмов и их спор в питательных средах, посуде, на инструментах и других предметах лабораторного оборудования. Для их стерильности наиболее часто пользуются воздействием высокой температуры.
СТЕРИЛИЗАЦИЯ ОБЖИГАНИЕМ НА ПЛАМЕНИ ГОРЕЛКИ
Небольшие стеклянные (палочка, шпатель) и металлические (игла, петля, пинцет, скальпель) предметы проводят несколько раз через пламя горелки. Стерилизация достигается обугливанием находящихся на их поверхности микроорганизмов. Обжиганием на пламени пользуются и для стерилизации поверхности ватных пробок.
Рис. 14
Значение температуры в разных
участках пламени газовой горелки
СТЕРИЛИЗАЦИЯ КИПЯЧЕНИЕМ
Стерилизацию металлических инструментов и резиновых трубок проводят кипячением. Так как споры некоторых бактерий сохраняют жизнеспособность при кипячении в воде в течение нескольких часов, то рекомендуется стерилизацию кипячением проводить в 2%-ном растворе карбоната натрия в течение 10 мин. В этих условиях споры погибают.
СТЕРИЛИЗАЦИЯ СУХИМ ЖАРОМ
Сухим жаром стерилизуют стеклянную посуду. При этом пробирки, колбы предварительно закрывают ватными пробками. Чтобы избежать заражения простерилизованных предметов из воздуха, их перед стерилизацией заворачивают в оберточную бумагу и вынимают только перед работой.
Пипетки перед стерилизацией с концов закрывают ватой. Затем их обертывают длинными полосками бумаги шириной 3,5–4 см. Бумагу наматывают по спирали, начинная с конца пипетки, который будет погружен в среду. Концы обертки закрепляют ниткой. Тонкие пипетки обертывают бумагой вместе по несколько штук.
Чашки Петри заворачивают в бумагу в форме квадрата, сторона которого приблизительно равна трем диаметрам чашки. Чашку Петри помещают на середину листа, загибают его с двух противоположных сторон кверху так, чтобы края налегали друг на друга. Два свободных конца загибают вниз. При таком обертывании у чашек легко различать верх и низ.
Подготовленную таким образом посуду помещают в сушильный шкаф, в котором нагревают ее при температуре 160–170°С в течение 2 ч (с момента установления нужной температуры). При таком нагревании погибают не только бактерии, но и их споры.
Температуру в сушильном шкафу выше 175°С допускать не следует, так как при этом ватные пробки буреют, а бумажная обертка становится ломкой.
СТЕРИЛИЗАЦИЯ ТЕКУЧИМ ПАРОМ (ДРОБНАЯ СТЕРИЛИЗАЦИЯ), ИЛИ ТИНДАЛИЗАЦИЯ
Питательные среды, воду, резиновые трубки и другие предметы, портящиеся от действия сухого жара, и питательные среды, портящиеся под действием высокой температуры (среды, содержащие молоко, солод, желатину), обеспложивают действием текучего пара.
Стерилизацию текучим паром производят в кипятильнике Коха или в автоклаве с открытым вентилем. Воду в них доводят до кипения, и образующийся пар обтекает стерилизуемые объекты. Температура стерилизуемых питательных сред достигает 100°С. Нагревание в течение 30–45 мин приводит к гибели вегетативных клеток бактерий, но споры их не погибают. Затем жидкость охлаждают до температуры, благоприятной для прорастания спор (до 30°С). Нагревание приводит к активации спор и более быстрому их прорастанию. На следующий день нагревание повторяют. При этом погибают вегетативные клетки, развившиеся из спор. Для обеспечения полной стерильности жидкость оставляют еще на сутки и снова повторяют нагревание. Такую стерилизацию называют дробной или тиндализацией.
ПАСТЕРИЗАЦИЯ
В основе пастеризации лежит нагревание жидкостей до температуры меньше 100°С. Целью ее является уничтожение неспороносных бактерий в жидкостях, теряющих питательные свойства при кипячении (молоко, пиво, вино и др.). Осуществляется пастеризация путем нагревания жидкостей при 60°С в течение 30 мин, или при 75°С в течение 15 мин, или при 80°С в течение 10 мин.
ХОЛОДНАЯ СТЕРИЛИЗАЦИЯ
Органические жидкости, не выносящие нагревания, освобождают от бактерий, пропуская через стерильные мелкопористые фильтры. Эти фильтры задерживают микроорганизмы, их называют бактериальными фильтрами.
Бактериальные фильтры имеют разные номера. Фильтры № 1 имеют средний диаметр пор 0,3 мкм и являются наиболее надежными. Фильтры № 5 имеют самые большие отверстия пор, диаметром 1,2 мкм.
Перед употреблением мембранные фильтры стерилизуют кипячением. Фильтры помещают в теплую дистиллированную воду и кипятят 30 мин, меняя 2– 3 раза воду.
