ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ПРОЦЕССОВ ПРОЛИФЕРАЦИИ, ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ И АПОПТОЗА У КЛЕТОК НЕЙРОБЛАСТОМЫ – Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

. 3. Гены компетентности к циклу (раннего ответа)

Гены myc, fos, myb и др.

Это ключевые гены пролиферации.

Под действием внешних факторов роста и гормонов (см. ниже), через

соответствующие цитоплазматические мессенджеры, эти гены

активируются и экспрессируют белки Myc, Fos, Myb, которые

активируют клетку к переходу G0/G1.

Клетка становится компетентной (способной) к митотическому циклу.

Т.о., гены компетентности работают в раннем пререпликативном

периоде. Соответствующие, белки Myc, Fos, Myb после синтеза

поступают из цитоплазмы (с рибосом) в ядро, где взаимодействуют с

хроматином и ядерным матриксом.

NB: англоязычные навания генов и белков принято писать по-разному:

гены – со строчной буквы курсивом (myc, fos, myb, cdc 8, cyclin D);

белки – с прописной буквы прямым шрифтом (Myc, Fos, Myb, Cyclin D), а

для многословных названий – аббревиатурой (семейство киназ CDK, киназы

Cdk1, Cdk2 …). Безымянные белки обозначают строчной буквой «p» (protein)

и массой в kD (p21, p34, p53 …)

• В частности:

• Семейство генов myc – кодирует белки,

ядерные фосфопротеиды (ок. 65 кД),

способные связываться с точками

«origin» ДНК и соединять их с ядерным

матриксом для подготовки ДНК к

репликации.

Транскрипция этих генов резко

активируется (в 20-30 раз!) через 1 ч

после стимуляции (из G0-состояния),

достигает пика через 3 ч и вскоре

снижается, задолго до начала S-периода.

(В опыте, под действием колоние-стимулирующего фактора (КСФ)

происходит быстрая экспрессия генов myc с угнетением цАМФ. Это

условие для выхода из G0 в цикл или дифференцировку).

• Ген fos продуцирует белок – тоже ядерный фосфопротеид (55 кД),

который еще раньше (через 15-20 мин после стимуляции)

связывается с ДНК и активирует гены типа myc, продукты которых

необходимы для запуска предстоящей репликации.

• Т.о., работает каскад:

ФР → Рецептор → Мессенджеры → fos →Fos → myc → Myc … → Origin

ДНК матрикс.

Действие генов fos и myc кратковременно, это гены раннего

пререпликативного периода (раннего ответа), факторы приобретения

клеткой митотической компетентности.

• Далее, в клеточном ядре белки этого каскада принимают участие в

активации генов отложенного ответа – ранних G1-киназ и циклинов,

ответственных за переход из G1 в S-период (см. ниже).

NB: Ранний ответ генов fos, myc и др.

соответствует первому пику транскрипции

в реакции плейотипического ответа

покоящихся клеток (см. выше о периоде

покоя).

NB: Действие генов myc и fos, т.е. белков

Myc и Fos, кроме прочего, направлено на

инактивацию и разрушение белка покоя

р27. Но об этом ниже.

. 4. Гены прогрессии цикла. Циклины и циклинзависимые киназы

• Для других генов – регуляторов митотического цикла установлено

время активности по ходу самого цикла. Мутации этих генов

останавливают соответствующие стадии цикла.

Это гены двух больших семейств – cdc (cell division cycle) и cyclin.

• Открытие генов семейства cdc связано с изучением

циклоспецифических мутантов дрожжей и культур клеток

млекопитающих (см. выше). Позже эти работы были сопоставлены с

открытием белкового фактора MPF в процессах созревания ооцитов и

дробления зиготы лягушки.

• Это интересная и драматичная история в изучении проблем

репродукции и дифференцировки клеток.

В 1971 г. у лягушки выявлен MPF (maturation/mitotic promotion factor),

запускающий в ооцитах деления созревания (мейоз), а также и митозы

первых делений дробления. В ооцитах MPF появлялся под действием

гормонального сигнала (прогестерона), так что это типичный эндогенный

регулятор, вырабатываемый самими ооцитами.

В дробящихся бластомерах активность MPF пульсирует: он появляется в

митозе и исчезает в интерфазе. При этом клетка совершает ритмические

сокращения, не зависящие от активности ядра. Сокращения сохранялись

при блокировании митоза, блокировании веретена, даже при удалении

ядра. Стало ясно, что в цитоплазме ооцита, зиготы, бластомеров работает

автономный осциллятор, колебательный цикл химических реакций

веществ, накопленных заранее (запас MPF или его мРНК).

Так сформировались два конкурирующих (казалось – взаимоисключающих)

представления о механизмах регуляции цикла:

• Механизм генного «домино», представляющий конвейер генетических

активностей семейства cdc, в котором каждый отработавший ген

включает следующий ген митотического цикла (на основе работ с

мутантными по циклу дрожжами и клеточными культурами).

• Механизм цитоплазматического осциллятора («часовой механизм»),

который заложен заранее и периодически включает весь комплекс

биохимических и структурных реакций митоза (на основе работ с

ооцитами лягушки и морских ежей).

Вскоре состоялся неожиданный синтез этих двух идей.

• В 1980-х годах была установлена идентичность белков,

инициирующих митоз в этих двух моделях:

(1) белка-продукта гена cdc-2, запускающего митоз у дрожжей, и

(2) одной из субъединиц MPF лягушки – белка p34, а также аналогичных

белков и генов у других животных, включая человека.

• Это оказалась одна и та же протеинкиназа – p34cdc-2 – фермент,

фосфорилирующий (при расщеплении АТФ) разнообразные белки,

участвующие в организации и течении митоза (см. ниже).

[Этим «золотым гвоздем» соединились две линии исследований, две,

казалось, альтернативные теории регуляции митотического цикла.]

• Вторая субъединица MPF была определена как белок-активатор

киназы и названа Cyclin B (циклин Б). То есть, киназа p34 работает

только в связке с циклином Б (гетеродимерная форма белка). Поэтому

безымянный до тех пор фермент класса протеинкиназ – p34 – получил

имя – Cdk1 (cyclin dependent kinaze 1 – циклин-зависимая киназа 1).

Cdk1 Cyclin B = Cdk1/Cyclin B

Неактивные формы киназы и циклина = Активная димерная форма

В первой половине митоза

(профаза-метафаза) киназа

Cdk1 под контролем циклина

CycB работает, а уже в анафазе

циклин разрушается и киназа

теряет свою активность.

В течение следующей

интерфазы циклин

синтезируется заново.

Перед митозом он

соединяется со своей киназой

Cdk1, активирует ее для

запуска нового митоза и в

анафазе разрушается.

В следующем цикле циклин

синтезируется заново.

Т.о., активность Cdk 1 циклически изменяется вслед за изменением

концентрации циклина. Отсюда и название киназы:

Cdk– cyclin-dependent kinaze – циклин-зависимая киназа.

• Так изменяется концентрация белков в клетке: Cdk1 (постоянная) и

Cyclin B (переменная) – в ходе митотических циклов.

• NB: Разрушение циклина обязательно для нормального завершения

текущего митоза и начала следующего цикла.

• Что же делает MPF = Cdk1/Cyclin B как триггер митоза?

Какие функции выполняет протеинкиназа Cdk1, активируемая

циклином В?

• Функции (активности) протеинкиназы Cdk1 в организации митоза:

1) фосфорилирует ламины ядерной оболочки и, тем самым, инициирует

ее распад;

2) фосфорилирует белки конденсины и гистон Н1, способствуя

конденсации хромосом;

3) фосфорилирует центросомный белок р225, способствуя сборке

веретена;

4) активирует APC (anaphase promoting complex) – ферментная система,

которая

– разрушает белок когезин хромосомных связок, делая возможным

расхождение сестринских хроматид,

– запускает протеолитическую деградацию собственного циклина В

(убиквитинация и расщепление ферментами протеасом).

• Т.о., протеинкиназа Cdk1, активированная циклином В, после

выполнения работы по запуску митоза сама же инициирует распад

своего циклина и становится неактивной.

Эта реакция обеспечивает кратковременность действия MPF.

• Так был расшифрован митотический осциллятор – MPF.

• Но, как и следовало ожидать, вскоре были открыты и другие

осцилляторы, стимулирующие переходы G1/S (SPF), S/G2 и всю

прогрессию интерфазы.

• Это тоже протеинкиназы, белки-ферменты семейства CDK (2, 4, 6…) –

продукты генов cdc, активируемые своими циклинами (A, C, D, E…).

Особенно важен SPF – комплекс Cdk2/Cyclin E,

обеспечивающий переход G1/S. Его функция –

фосфорилирование регуляторного белка pRb

(открыт как супрессор опухоли ретинобластомы,

но оказался универсальным супрессором любого

митотического цикла в точке перехода G1/S).

В активной (дефосфорилированной) форме pRb

блокирует фактор транскрипции E2F,

необходимый для синтеза белков, запускающих

и поддерживающих репликацию ДНК.

Т.о., фосфорилирование pRb с помощью киназы Cdk2 освобождает и

активирует фактор транскрипции E2F, разрешая начало синтеза ДНК.

• Транскрипционный фактор E2F поддерживает также синтез самого

циклина Е, обеспечивая поддержку репликации по всему S-периоду.

• Эти и другие комплексы Cdk/Cyclin и время их активации показаны ниже.

• NB:

В раннем эмбриогенезе (дробление зиготы, бластула) работают в

чистом виде только 2 осциллятора: Cdk1/CycB (MPF) и Cdk2/CycE (SPF).

Работают независимо от ядра, без транскрипции, так как они (или их

иРНК) накоплены в цитоплазме в периоде роста ооцита, как и многие

другие регуляторы раннего эмбриогенеза.

Это простейший митотический цикл – без G1-периода, часто и без G2.

• В соматических клетках, начиная с гаструлы, включается

морфогенетическая (транскрипционная) функция ядер, начинает

работать вся система генетического контроля цикла.

У млекопитающих, по разным данным, это 7-12 видов Cdk и 9-14 видов

циклинов.

При этом одна киназа может работать с несколькими циклинами и

наоборот, так что регуляторный пул очень велик и многообразен.

Цикл удлиняется, появляются G1- и G0-периоды, необходимые для

исправления возникающих мутаций и ошибок репликации, а также для

ожидания сигналов к дифференцировке.

1. Общая характеристика системы регуляции

• На деление клеток могут действовать самые разные факторы: биогенные

и абиогенные, химические и физические, непосредственные и

опосредованные, стимуляторы и ингибиторы:

– влияющие на синтез нуклеотидов, ДНК, РНК, белков;

– влияющие на синтез и накопление АТФ (энергетический «резервуар»

митоза), особенно ингибиторы гликолиза и дыхания;

– влияющие на формирование митотического веретена.

• Это могут быть неспецифические факторы, модифицирующие цикл, часто

побочные (температура, оксигенация, токсины и др.).

• Нас интересуют здесь специфические регуляторные факторы, специально

предназначенные для управления клеточным циклом.

Очевидно, что в гистогенезах изменения параметров

цикла, задержки в G0, выход в дифференцировку –

это отражение действия каких-то регулирующих

факторов.

• Действие таких регуляторов возможно в точках

повышенной чувствительности (точка r, check points)

клеточного цикла.

• Механизм регуляции клеточного размножения – системный.

Он состоит из многих параллельных и, в то же время, иерархичных звеньев

регуляции. У многоклеточных животных (наиболее сложная система) он

включает следующие уровни регуляции:

1) Клеточные регуляторы: ядерные (генетические), цитоплазматические

(вторичные мессенджеры), мембранные (рецепторы);

2) Организменные регуляторы: гуморальные местные, тканеспецифические

(факторы роста, ингибиторы), гуморальные дистантные, ткане- и видонеспецифические (гормоны – стимуляторы и ингибиторы), нервные, от

ЦНС через гипоталамус на аденогипофиз и далее на местные

эндокринные железы;

3) Средовые регуляторы: через ЦНС, непосредственные абиотические,

модифицирующие (тепло и др.).

• NB: На разных уровнях регуляции есть как стимуляторы ( ), так и

ингибиторы (-).

Давно существовало 2 противоположных взгляда на сам принцип

регуляции митозов:

• Митогенная регуляция:

нормальное состояние клетки – покоящееся, а для деления

необходимы стимуляторы, митогены.

• Ингибиторная регуляция:

нормальное состояние клетки – непрерывная пролиферация, которая

ограничивается ингибиторами.

• Что верно? Или все сложнее?

. 5. Система контрольных точек и ингибиторы митотического цикла

• Т.о., события митотического цикла представляют взаимосвязанную

цепь шагов: репликация ДНК, удвоение центросом и формирование

веретена, разрушение ядерной оболочки, компактизация и

разделение хромосом, цитокинез …

• При этом в нормальном цикле нарушение одной стадии обычно

приводит к задержке следующих стадий, хотя далее возможно

продолжение цикла с перескоком через стадию.

Например, если в температурочувствительных (ts) мутантах по ДНКполимеразе остановлена репликация ДНК, то и митоз, и цитокинез

останавливаются.

• Почему в этих условиях не активируется Cdk1/CyclinB, не собирается

веретено, не расходятся хромосомы?

• В начале 1990-х годов выдвинута гипотеза (Хартвел и др., 1989-92),

которая объясняло этот феномен.

Гипотеза Хартвела:

• В клетке существует контрольный механизм – система надзора за

митотическим циклом. Должны быть специальные ингибиторы

митотических киназ – CKI (cyclin kinaze inhibitor), которые

останавливают цикл, если предыдущий шаг не пройден.

• Это система контрольных точек (check point) – короткие остановки на

переходных стадиях цикла, в которых клетка с помощью специальных

молекулярных сенсоров оценивает состояние своих структур,

ферментов, ДНК на их готовность к дальнейшим шагам по циклу. Если

обнаруживаются нарушения, вырабатывается негативный сигнал и

цикл приостанавливается.

• Число контрольных точек, по-видимому, равно числу промоторов

Cdk/Cyclin. Сначала (дробление зиготы) активны 2 из них – для SPF и

MPF. Позже (гаструляция) включаются остальные (у Xenopus от стадии

800-клеточного зародыша). Включение контрольных точек и есть

реальная причина замедления циклов, появления G0-, G1-, G2задержек.

• Наиболее важен и сложен р53-р21/Waf1-pRb–зависимый путь

(опухолевой супрессии), который останавливает клетки на границе

G2/M и G1/S в случае нарушений репликации ДНК.

• При неполной или неправильной репликации, при повреждениях ДНК

(например радиацией) с помощью специальных сигнальных белков

(р19 и др.) активируется главный «сторож цикла» – белок р53 (фактор

транскрипции), который активирует промотор и запускает ген для

синтеза белка р21/Waf1 из семейства INK4 (от Inhibitor of Cdk). Этот р21

является универсальным ингибитором различных СD-киназ – подавляет

активность Cdk1 (=блок митоза) или Cdk2,4,6 (=блок G1/S) до устранения

разрывов и завершения репаративных синтезов ДНК.

Если ДНК не репарируется, р53 при достижении критической

концентрации стимулирует синтез каспаз и запускает апоптоз.

• Другой универсальный ингибитор CD-киназ – белок р27/Kip1 –

обеспечивает более стойкое и глубокое блокирование Cdk2,4,6 и

перевод клетки в период покоя G0. Преодоление этого блока,

разрушение р27, возможно с участием белков/генов компетентности

Mycmyc, Fosfos… (см. выше) под влиянием факторов роста и гормонов (см.

далее).

• Прочие ингибиторы цикла (CKI): из семейства KIP – р57; из семейства

INK4 – р15, р16, р18, р19.

• NB: Транскрипционный фактор р53 участвует также в запуске синтезов

мРНК (и, соответственно, белков), направляющих клетку в

дифференцировку. Так увязаны выход клеток из митотического цикла

и начало их тканевой специализации.

• И еще одно важное NB:

Все гены белков-стимуляторов и промоторов цикла (гены

компетентности, гены cdc, производящие киназы семейства CDK, гены

циклинов, гены соответствующих сигнальных путей и прочие)

являются протоонкогенами. Их повышенная экспрессия, например,

при случайной активации их промоторов или в результате

привнесения их мутированных форм вирусами, превращает эти

нормальные гены пролиферации в онкогены и ведет к постепенно

нарастающему, избыточному, опухолевому росту ткани.

• Соответственно, все гены белков-ингибиторов цикла (белков CKI,

особенно р53 – сторож цикла, pRb и др.) должны быть обозначены

как антионкогены, в онкологии это опухолевые супрессоры. Однако

их мутации, недостача, утрата в результате неправильного митоза –

тоже путь к опухолевой трансформации клеток, причем гораздо более

короткий и радикальный, чем накопление мутаций протоонкогенов.

Достаточно одной р53-дефицитной клетки, чтобы породить

мутантный клеточный клон и быстро растущую раковую опухоль.

• Но это отдельная большая тема, можно сказать, специальная медикобиологическая наука – онкобиология. Ее изучение за пределами

нашего спецкурса.

. 6. Факторы роста

Сколько бы генов не было задействовано в обеспечении цикла данной

клетки, их регуляция идет извне.

Исторически идея стимуляции митозов развивалась через ряд теорий.

1. Теория митогенетических лучей (полей), испускаемых яйцеклеткой,

зиготой, зародышем (Гурвич, 1930-е годы).

2. Теория некрогормонов (1950-е годы), согласно которой поврежденные

клетки освобождают активные митогенные вещества – стимуляторы

пролиферации (некрогормоны, раневые гормоны). Это – продукты

распада белков или НК.

3. Современное представление о «факторах роста», которые совместно с

гормонами управляют размножением и дифференцировкой клеток.

Сегодня этой системе отводится центральная роль в организации роста

и морфогенезов.

• Действие ФР в чистом виде можно изучать на клеточных культурах in

vitro, так как в организме (in vivo) это действие опосредовано и

скооперировано со всей системой регуляции.

• Давно известно, что для роста клеточных культур в искусственную

питательную среду необходимо добавлять 5-10% сыворотки крови,

лучше фетальной (эмбриональной, плодной). В ней содержатся

различные биогенные стимуляторы, которые и были названы

факторами роста. Для растительных культур это – соответствующие

гормоны роста (ауксины и др.).

Без этих факторов клетки не размножаются, переходят в G0-, реже в

G2-период.

6.1. Общие свойства и механизм действия факторов роста (ФР-GF)

1) ФР синтезируются в разных органах и тканях, многие в клетках крови – как

правило вне регулируемой клеточной популяции (вне клеточной мишени).

2) ФР распространяются через кровь (эндокринные ФР) или диффузно через

межклеточные жидкости (паракринные, местные). Некоторые

паракринные ФР могут быть автокринными – секретируются, но

регулируют функции самой клетки-производительницы.

Известны также юкстакринные факторы – сигнальные молекулы в форме

интегральных

белков

плазмалеммы

(не секретируются,

действуют

контактно

на рецепторы

соседних клеток).

3) ФР присутствуют в ткани и работают в очень малых концентрациях – 10-9

– 10-11 М.

4) ФР действуют, как правило, на несколько функционально связанных

типов клеток – относительно тканеспецифично.

5) ФР – это несколько семейств полипептидов, многие с тремя -S-S-связями

(6 остатков цистеина) (гомология в пределах семейства).

6) ФР действуют на клетку-мишень, как и пептидные гормоны – через

рецепторы плазмалеммы. Внутриклеточный сигналинг осуществляется

обычно с участием каскадов вторичных мессенджеров.

Цитоплазматический домен рецептора (эффектор) может быть

различным и комплексным:

– тирозинкиназа – фосфорилирует

сигнальные белкимессенджены по тирозину

(факторы FGF, EGF, IGF и др.);

– серин-треонинкиназа –

по серину и треонину (TGF-β);

– диацилглицеролкиназа,

фосфолипаза С и другие

(разные ФР).

7) Цитоплазматический сигналинг от рецепторов к ядру происходит с

участием актиновых микрофиламентов цитоскелета (выявлены

прямые контакты рецепторов с актином, быстрая реорганизация

микрофиламентов, в т.ч. стресс-фибрилл, при контакте рецептора с

ФР).

• NB: Рецепторы локализованы на фокальных контактах клетки с

внеклеточным матриксом, здесь же вход сигнала. Распластанные

(фиксированные) клетки чувствительны к ФР.

8) Конечное действие мессенджеров – на хромосомы: активация

транскрипционных факторов (ТФ) для генов компетентности (myc,

fos, myb), генов прогрессии цикла (cdc, cyclin) и других генов,

управляющих циклом и дифференцировкой клеток.

Пример:

система сигналинга при

взаимодействии клетки с

фибробластическим фактором

роста (FGF).

FGF-лиганд связывается со своим

рецептором (известны 4 формы –

FGF-рецепторов).

Взаимодействуют 2 рецептора.

Их цитоплазматические домены –

тирозинкиназы – при

возбуждении FGF-лигандом

автофосфорилируются, после чего

фосфорилируют белок-адаптор –

один из элементов сигналингкаскада. Фосфо-белок-адаптор

активирует G-белок RAS:

RAS-GDP→RAS-GTP.

Далее через цепочку MAP-киназ

(RAF-MEK-ERK) фосфорилируется

транскрипционный фактор.

Теперь его активная фосфо-форма

включает экспрессию нужного

гена.

• Активированная рецепторная тирозинкиназа (RTK) стимулирует также

фосфолипазу С, которая расщепляет фосфатидилинозитолдифосфат

(PIP2) на инозитолтрифосфат (IP3) и диацилглицерол (DAG), что вед к

изменению ионного состава цитоплазмы.

• NB: Как правило, ФР регулируют не только репродукцию клеток, но и

их дифференцировку, выступая не только стимуляторами митоза, но

где-то и ингибиторами.

Т.е. ФР в целом контролируют весь морфогенез.

6.2. Разнообразие факторов роста

Известны десятки семейств ФР (GF). Рассмотрим некоторые, наиболее

изученные у млекопитающих животных и человека.

1. EGF – Epidermal Growth Factor; = ЭФР – Эпидермальные ФР.

Полипептид из 53 аминокислот, включающий 6 остатков цистеина, т.е. 3 S-Sмостика. Сигналинг через тирозинкиназный эффектор, белок-адаптор и

цепочку киназ (как показано выше).

2. Доказательства генетического контроля цикла

• Установлено, что последовательность фаз митотического цикла (-G1-SG2-M-) контролируется периодической активностью определенных

генов.

В крайнем выражении эта закономерность известна как принцип

домино: очередной ген включается продуктами предыдущего гена.

• Доказательства генетического контроля цикла складывались из

разных фактов, экспериментов: цитологических, биохимических,

генетических.

2.1. Опыты по слиянию клеток HeLa

Разработаны методы гибридизации (слияния) клеток. Получение

гетерокарионов – клеток с различающимися ядрами.

Объединяли гомологичные однолинейные клетки (культура HeLa), но

находящиеся в разных фазах митотического цикла (гетерофазные

клетки).

• Показали наличие фазово-специфических индукторов и ингибиторов

митотического цикла.

1) S G1

В G1-ядре сразу начинается синтез ДНК.

Вывод: G1-ядро готово к репликации, но ее начало

зависит от присутствия какого-то индуктора, который

образуется на границе G1/S. В опыте G1-ядро

получает его от цитоплазмы S-фазной клетки.

Т.о., для запуска S-фазы требуется некий индуктор

синтеза ДНК – SPF (Synthesis Promoting Factor).

2) S G2

В G2-ядре новый синтез ДНК не стимулируется, даже

с помощью дополнительного SPF (от S-фазной клетки),

реплицированные хромосомы не восприимчивы к

SPF.

Ожидаемый в G2-ядре митоз задерживается, пока не

закончится синтез ДНК в S-ядре.

Вывод: в G2-ядре ДНК защищена от повторной

репликации специальным ингибитором – SDF

(Synthesis Delaying Factor).

Для запуска митоза необходим М-индуктор?

В опыте он разбавляется цитоплазмой S-клетки?

3) G1, S, G2 M

В интерфазном ядре начинается

преждевременное разрушение ядерной

оболочки и конденсация хромосом (инициация

митоза, наиболее полная в G2-ядре).

Вывод: в цитоплазме М-клетки присутствует в

высокой концентрации некий индуктор митоза –

MPF (Mitosis Promoting Factor).

(по: Ченцов, 2004)

4) G1 G2

G1-ядро проходит цикл по графику,

в G2-ядре блокируется начало митоза.

Вывод: митоз начинается лишь при критическом

уровне MPF (в опыте он разбавляется G1-клетой).

Возможно также присутствие в цитоплазме

сигнала задержки митоза – MDF (Mitosis Delaying

Factor). (Показана задержка митоза избытком

одноцепочечной ДНК).

Т.о., смена периодов митотического цикла контролируется выработкой и

накоплением в определенных концентрациях специальных индукторов

и ингибиторов цикла:

– SPF – активатор синтеза ДНК,

– SDF – S-задерживающий фактор,

– MPF – М-стимулирующий фактор,

– MDF – М-задерживающий фактор.

• Регулярная смена этих факторов в цитоплазме и кариоплазме

разграничивает ряд событий хромосомного цикла, предотвращая

неувязки (вроде конденсации хромосом посреди S-фазы или повторной

репликации перед митозом).

• Каковы же природа и происхождение этих факторов?

2.2. Опыты по ингибированию синтезов РНК и белка в цикле –

ингибиторный анализ для выявления возможной роли РНК и белков в

регуляции митотического цикла (Епифанова, 1973).

Опыты на клеточных культурах, синхронизированных по циклу.

Синтезы РНК и белков блокировали соответствующими ингибиторами:

– ингибитор синтеза РНК – антибиотик актиномицин D (связывается с

ДНК и блокирует транскрипцию).

– ингибитор синтеза белка – пуромицин (блокировка связи мРНКтРНК) или циклогексимид (блок мРНК-рибосома).

Ингибиторы добавляли в культуру в точно известное время до

ожидаемого наступления S-периода или митоза и регистрировали

время наступления их задержки.

Результат 1. Запуск S-периода.

Если перед самым началом ожидаемого S-периода блокировать синтез

белков, то репликация ДНК не наступает (даже кратковременная

блокада задерживает начало S). Блокада синтеза РНК эффективна на

более ранних сроках (1 ч до начала S и раньше).

Следовательно, для инициации репликации ДНК необходимо:

(1) перед самым началом S-периода – синтез какого-то белка, это SPF;

(2) мРНК для этого синтезируется за 1-2 ч до начала S;

(3) рРНК для рибосом, обеспечивающих этот синтез белка, образуется

раньше, в G2-периоде предыдущего цикла.

Результат 2. Запуск митоза.

Аналогично, блокада синтезов белка и РНК в G2-периоде, перед митозом,

приводила к его задержке или полной остановке.

Т.о., показано, что для инициации митоза необходимы:

синтез белка – MPF, который происходит в G2-периоде за 10-30 мин

до митоза;

синтез мРНК для этого MPF – за 1-2 ч до митоза;

синтез рРНК – за 2-3 ч до митоза.

Т.о., ингибиторный анализ показал, что:

1) индукторы SPF и MPF вырабатываются самой клеткой, это

собственные, внутриклеточные регуляторы митотического цикла;

2) это белки, а значит – продукты определенных генов – регуляторов

цикла;

3) активация и экспрессия регуляторных генов цикла происходит

непосредственно перед началом контролируемого процесса –

S-фазы или митоза.

NB:

Начало S-периода и запуск митоза – две важнейшие контрольные точки

(check points), имеющие генетическое управление.

Существуют ли другие контрольные точки и контролирующие их гены?

Существует ли «система домино», управляющая клеточным циклом?

2.3. Генетические доказательства генной регуляции цикла. Генное

семейство Сdc

Лучшее доказательство генной регуляции того или иного процесса (или

структуры) – найти в природе мутации этого процесса (структуры).

У различных эукариот обнаружены циклоспецифические мутанты.

Дрожжи.

На дрожжах началось систематическое изучение генетики размножения

клеток. Большой вклад внесли исследования лаборатории Hartwell’а

(1968 – 1978, 1995 гг.).

Дрожжи имеют продолжительную гаплоидную стадию в жизненном

цикле (связано с мейозом, образованием спор), что способствует

выявлению рецессивных мутаций.

У дрожжей выявлено около 50 фенотипических мутаций по дефектам

клеточного (митотического) цикла. Это значит, что не менее 50 генов

управляют циклом.

Это семейство генов обозначено как гены cdc – cell division cycle.

В делении дрожжей различимы 3 относительно независимых цикла (как и у

других эукариот), и каждый из них имеет несколько мутаций (значит,

управляется несколькими генами). Ниже показаны только некоторые из них.

Стартовую точку и следующий митоз запускает ген cdc 28 (у почкующихся

дрожжей) или его гомолог cdc 2 (у делящихся дрожжей).

Синтез ДНК инициирует ген cdc 8 (в хромосомном цикле).

Репродукция центриолей (у дрожжей – внутриядерные ЦОМТы) зависит от

гена cdc 31 (в центросомном цикле).

При подготовке деления (почкования) ядра активен cdc 24, телофазу и

цитокинез контролирует cdc 15 (в цитокинетическом цикле) и т.д..

Клетки млекопитающих.

В различных клеточных культурах выявлены циклоспецифические

мутации, гомологичные cdc-мутациям дрожжей.

При нормальной температуре (37°) клетки делятся нормально. Но при

пониженной (34°) или повышенной (39°) температуре клетки

останавливаются в той или иной стадии цикла: возможны блок

цитокинеза, блок анафазы, блок распада ядерной оболочки, блок

перехода G1/S и другие. Значит, все эти процессы контролируются

определенными генами.

Известно более 30 циклоспецифических мутантных

(температурочувствительных) линий клеток млекопитающих. Всего,

включая протоонкогены, определено более 100 генов, управляющих

клеточным (митотическим) циклом.

. 7. Гормоны и пролиферация клеток

В отличие от факторов роста настоящие гормоны – продукты

эндокринных желез.

Биохимически различаются три группы гормонов:

• моноамины,

• стероиды,

• пептиды.

Роль гормонов состоит в регуляции роста, развития и функционирования

органов и тканей, включая регуляцию клеточного размножения и

дифференцировки.

7.1. Моноамины

Моноаминовые гормоны образуются из аминокислот путем небольшой

перестройки. Это – неспецифические регуляторы роста и

дифференцировки клеток разных тканей.

Тирозин → норадреналин, адреналин (катехоламины мозгового

вещества надпочечников), тироксин (гормон щитовидной железы).

• Норадреналин – стимулятор, сокращает клеточный цикл в различных

тканях.

• Адреналин – действует на другие рецепторы и подавляет клеточное

размножение, работает как универсальный ингибитор пролиферации.

При этом запускает в организме комплексную стрессовую реакцию.

Согласно теории кейлонов –

тканеспецифичных ингибиторов

пролиферации, выделяемых

зрелыми клетками против своего

же камбия, адреналин является

«орудием» в действии кейлонов.

Кейлон обеспечивает

тканеспецифич-ность реакции, а

адреналин – ингибирование.

На основе тирозина образуются также

ингибиторы у гидроидов: гомарин и

тригонеллин.

Это нейросекреты нейронов головы и

подошвы гидры. Задерживают

метаморфоз, регенерацию головы и

столона. В межклеточном веществе

создают градиенты вместе с

пептидными активаторами.

• Триптофан → серотонин, триптамин и др. (индольные производные).

Это неспецифические факторы эмбрионального развития разных

животных, стимуляторы регенерации планарии, моллюсков, печени

млекопитающих и в других случаях. (Например, серотонинэргические

нейроны активны в личиночном нейрогенезе у моллюсков, а также резко

активируются при регенерации нервов и ганглиев ЦНС.)

• Прочие моноамины, образуемые из пищевых аминокислот: гистамин,

путресцин, спермин, спермидин – ткане- и видонеспецифические

стимуляторы пролиферации.

• NB: У всех моноаминов очень слабая (или вообще отсутствует) видовая и

тканевая специфичность. Содержание путресцина, спермина и

спермидина повышено в любых растущих тканях: плаценте,

регенерирующей печени, опухолях и др. Это отражает их давнее

происхождение! Моноамины – древнейшие и простейшие регуляторы

клеточного размножения и роста. Имеются уже у цианобактерий.

Образование более сложных гормонов шло посредством реакций

поликонденсации – в направлении стероидов и полипептидов.

7.2. Стероидные гормоны

Реакция поликонденсации: терпены → стероиды:

Терпен (С5Н8)2 – димер углеводорода изопрена

Сесквитерпены (С5Н8)3 → Фарнезол → Ювенильный гормон членистых

(стимулирует размножение клеток и рост, препятствует линьке).

Дитерпены (С5Н8)4

Тритерпены (С5Н8)6 → (циклизация) → циклопентанопергидрофенантрен

→ холестерин → разнообразные стероидные гормоны.

(Перестройки за счет кетонирования (=О), окисления (-ОН),

метилирования (-СН3), ацетилирования и других радикалов, а также

двойных связей в кольцах).

• Экдизон – гормон линьки у Ecdysozoa (нематоды, приапулиды,

членистоногие).

Антагонист ювенильного гормона, а значит, ингибитор пролиферации.

• Кортикостероиды – гормоны коры надпочечников позвоночных.

Функционально различаются: глюкокортикоиды (кортикостерон, кортизон,

гидрокортизон), минералкортикоиды (альдостерон и др.).

Характерен двойственный эффект (±) в зависимости от дополнительных

факторов.

Например, гидрокортизон в чистом виде (без сыворотки) усиливает

действие EGF на клетки HeLa (способствует связыванию ФР с

клеточными рецепторами), но в присутствии сыворотки (т.е. в сумме с

другими ФР) ингибирует размножение тех же клеток.

Тот же гидрокортизон на фибробластах 3Т3 усиливает действие EGF

(работает как синергист ФР), но ингибирует действие FGF (антагонист

ФР). Дексаметазон вместе с сывороткой стимулирует миобласты, но

ингибирует фибробласты.

• Половые гормоны.

Мужские половые гормоны семенников (частично коры надпочечников,

яичников): тестостерон, андростерон и др.

Женские гормоны яичников (частично семенников, коры надпочечников):

прогестерон, эстрадиол, эстрон и др.

Кроме прочего, стимулируют мейоз – запускают сигнальный путь на синтез

MPF.

• Механизм действия стероидов

отличается от действия других

гормонов. Они проникают сквозь

плазмалемму и находят свой

рецептор в цитоплазме, далее

проникают в ядро и становятся

организаторами транскрипции

для соответствующих групп

генов.

NB: Стероидные гормоны в целом более видо- и

тканеспецифичны, чем моноамины, но все же их

специфичность ограничена.

Все они эволюционно консервативны.

7.3. Пептидные гормоны

Имеются уже у низших многоклеточных.

• ПМГ – пептидный морфоген гидры –

нейропептид из 11 аминокислот.

Секретируется нейронами «головы» и

стимулирует деление стволовых (i) клеток,

которые дают в первую очередь новые нейроны,

потом эпителий (ПМГ – активатор головы).

Вместе с активатором подошвы, а также

моноаминовыми ингибиторами (см. выше)

создает морфогенетические градиенты (поля)

вдоль тела гидры, направляющие векторный

рост и регенерацию: от подошвы растет голова,

от головы – подошва.

• NB: ПМГ еще малоспецифичен, его гомологи есть у других животных.

ПМГ активен даже в отношении клеток млекопитающих. Используется

в медицине для стимуляции роста легочного, кожного и других

эпителиев.

У позвоночных полипептидные гормоны очень разнообразны, более тканеи видоспецифичные. Хорошо выражена иерархия источников:

• – Нейропептиды гипоталамуса (рилизингпептиды):

соматолиберин, кортиколиберин,

тиролиберин и др. либерины (всего 7);

соматостатин и др. статины (всего 3).

• – Тропные гормоны аденогипофиза

(передней доли гипофиза): соматотропин

(СТГ), кортикотропин (АКТГ), тиреотропин

(ТТГ), гонадотропины (ФСГ, ЛГ), пролактин

и др.

• – Гормоны периферических эндокринных

желез – большей частью моноамины и

стероиды. Среди пептидных гормонов

малоспецифичные инсулин, кальцитонин

(паратгормон) – вовлечены в регуляцию

размножения клеток в красном костном

мозге, тимусе, печени и др.

7.4. Комплексное действие гормонов и других регуляторов

Важно то, что один и тот же тип клеток регулируется группой факторов

разной сложности и специфичности, например:

СТИМУЛЯЦИЯ

ИНГИБИРОВАНИЕ

Путресцин

Дексаметазон

Кортизол

Инсулин

Несколько ФР

(FGF, EGF, PDGF …)

И др.

Кортизол

ФИБРОБЛАСТЫ

Интерферон

Тканеспецифичные

пептиды-ингибиторы

CD-киназ, кейлоны

И др.

При этом сами регуляторы встроены в сложные иерархические цепи

(сети) управления с возможностью изменения уровня активности.

Например, сеть управления через СТГ (соматотропный гормон) включает:

ГИПОТАЛАМУС

ЭПИФИЗ

рилизинг-пептиды

↓соматолиберин – (стимуляция) → ( ) ГИПОФИЗ ( ) ← серотонин – (стимуляция)

соматостатин – (угнетение) →→→ (–) ↓ ↓ ↓

СТГ ТТГ АКТГ и др.

↓↓↓

Пролиферация гепатоцитов, энтероцитов и др.

Стимулирует выделение печенью соматомедина – ускоряет рост костной и др. тканей.

Стимулирует образование в тканях полиаминов –

– неспецифическая стимуляция…

Причем в сетях возможны каскадные реакции превращения неактивных

форм регулятора в активные и наоборот, с участием разнообразных

ферментов, например:

кортизон → кортизол (= гораздо более сильный стимулятор);

норадреналин → адреналин (= смена стимуляции на угнетение).

• Таким образом, гормоны включены в кооперативное действие всех

регуляторов пролиферации и дифференцировки, в комбинации с

несколькими факторами роста, специфическими и неспецифическими

ингибиторами. Поэтому для гормонов, как и для некоторых факторов

роста (см. выше) характерны двойственные (стимулятор-ингибитор)

эффекты.

• Система экзогенной регуляции пролиферативных процессов и

дифференцировки клеток многоклеточных организмов усложнялась в

ходе биологической эволюции.

У высших животных клеточная пролиферация в тканях регулируется

сочетанием филогенетически древних факторов – видо- и

тканенеспецифических (амины, стероиды) и более молодых –

специфичных (полипептидные гормоны и факторы роста). При этом

действие древних неспецифических факторов становилось

подчиненным, они использовались как усилители сигналов от новых,

более ткане- и видоспецифичных регуляторов. Т.е. специфические

регуляторы (полипептидные гормоны и ФР) в ходе эволюции дополняли

систему регуляции, которая изначально (у одноклеточных) была

довольно примитивной – неспецифической. Появлялись и

соответствующие наборы клеточных рецепторов, усложнялись

межклеточные и межтканевые взаимодействия.

Активация процессов пролиферации

Регуляция пролиферации и ее активация осуществляется плазматической клеточной мембраной. На этой мембране происходят процессы, при которых осуществляется переход клетки из состояния покоя в активное состояние для деления. В плазматической мембране имеются рецепторы, которые принимают сигналы к митотическому делению и способствуют транспорту в клетку необходимых компонентов для запуска процессов пролиферации.

В качестве митогенных сигналов могут выступать взаимодействия клеток между собой, а также контакт клетки с матриксом или с разными соединениями, способствующим вступлению в митоз (факторы роста). Клетка, которая получила сигнал к делению, запускает клеточный цикл.

Библиографическая ссылка

Мякишева С.Н., Крестинина О.В., Асланиди К.Б. ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ПРОЦЕССОВ ПРОЛИФЕРАЦИИ, ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ И АПОПТОЗА У КЛЕТОК НЕЙРОБЛАСТОМЫ // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2021. – № 12-8. – С. 1451-1455;

Регуляция цикла на клеточном уровне

Регуляция пролиферации клеток обеспечивает не просто контроль над клеточным циклом, а выход клетки с нормальным геномом. При регуляции клеточного цикла обеспечивается чередование фаз выраженной пролиферации и относительного покоя. Все факторы, которые участвуют в регуляции и пролиферации, разделяются на экзогенные или эндогенные.

Внешние факторы находятся во внешней среде и влияют на клетку через плазматическую мембрану. Факторы, которые находятся внутри клетки, относятся к эндогенным. Это довольно условное разделение, поскольку часть внутренних факторов могут поступать во внеклеточное пространство и действовать на другие клетки извне.

. Заключение

В целом получается такая система регуляции клеточного размножения.

1) Клетка генетически запрограммирована на пролиферацию.

Синтез белков – стимуляторов клеточного цикла (Cdk) идет постоянно, и

вместе с соответствующими циклинами они задают график течения

цикла. Главные из них (и минимально достаточные) – белки SPF

(Cdk2/Cyclin E) и MPF (Cdk1/Cyclin B).

2) Но в клетке есть и гены негативного контроля цикла, экспрессирующие

белки-ингибиторы циклинзависимых киназ (CKI): p19, p21, p27,…p53,

p57, pRb, а также TGF β, интерферон и другие ингибиторы.

В G1-периоде каждого очередного цикла (в точке r, check point) эти

белки подавляют гены подготовки нового синтеза ДНК (cdk 6, 4, 2, cyclin

D, E) и направляют клетку в период покоя G0.

3) У одноклеточных переход через точку r в новый цикл регулируется

наличием или отсутствием пищи, феромонов и других активаторов

цикла.

У первых многоклеточных экзогенные индукторы – моноамины,

стероиды, олигопептиды – дополнили систему регуляции, и далее она

усложнялась с участием нейросекреторных, эндокринных (гормоны) и

паракринных (факторы роста) полипептидов.

Факторы роста через рецепторы и внутриклеточные мессенджеры

активируют транскрипционные факторы (ТФ) генов компетентности

(myc, fos, myb и др.); экспрессируемые этими генами белки блокируют

белки-ингибиторы (прежде всего p27), изменяют структуру хроматина

и выводят клетку из состояния покоя G0.

4) Другие факторы роста аналогичными путями повышают экспрессию

генов прогрессии цикла (сdk/cyclin); продуцируемые белки семейств

Cdk и Cyclin обеспечивают продвижение клетки по циклу: G1-S-G2-M,

до нового G0-периода (позитивный контроль цикла). Негативный

контроль с помощью белков CKI создает паузы для исправления

ошибок репликации.

5) Гормоны и пептидные ингибиторы модифицируют (подавляют или

усиливают) действие факторов роста, регулируя переходы к

дифференцировке клеток и апоптозу.

Т.о., у высших многоклеточных животных, с их сложной органнотканевой структурой, в экзогенной регуляции клеточного

размножения факторы роста специализируют действие гормонов и

других неспецифических регуляторов. Центральная нервная система

(через гипоталамус) и факторы внешней среды выступают как еще

более удаленные эпигенетические регуляторы роста и развития.